基本概念RNA是什么？cDNA是什么？内参是什么？ real time PCR 是什么？
基本概念RNA是什么？cDNA是什么？内参是什么？ real time PCR 是什么？
废话不多说，前路无铺垫，直接上干货。
1、基本概念RNA是什么？cDNA是什么？内参是什么？ real time PCR 是什么？
RNA分为mRNA, tRNA, microRNA…使用trizol提取的是总RNA，并且总RNA中mRNA含量最多，其他的量很少，所以默认提出来的就是mRNA。cDNA是由mRNA反转录来的DNA，实验中需要用到cDNA，获得方法就是把实验对象的mRNA通过反转录试剂盒人工制造出来，最后使用real time PCR方法研究cDNA的相对含量。
PCR有很多种，核心就是用引物挑选出特定的DNA，再把这些DNA以指数方式倍增，达到可以观察到的量，再通过不同的观察方法比较DNA相对表达的高低。一个有意义的普通PCR包括：DNA的扩增+跑胶+在紫外光下观察条带的粗细强弱。
很多人认为real time PCR 简称RT-PCR……实则不然，很多经验丰富的人也会弄混各种PCR的名字。
（1）RT-PCR：反转录PCR(reversetranscription-PCR)，步骤包括RNA的提取，反转录，cDNA的扩增。
QRT-PCR（quantitative）是在RT-PCR体系中引入了“内参”这个概念。内参基因是所谓的管家基因，无论样本受到了什么样的处理，都默认这个管家基因会稳定表达，所以如果我们要研究的这个基因（假设是BCL-2）和管家基因（内参）都少了，但是它们两个之间的比值不变，那我们研究的这个BCL-2基因貌似表达下降，实则没有变化。内参就是一杆标尺，它的改变可能是因人为操作、系统性误差等等原因，但是不应该是由于管家基因表达发生了变化。如果是研究糖代谢的自动避开GAPDH，研究细胞骨架的屏蔽β-actin,内参还有很多，总有一款适合你~QRT-PCR实验中，有了内参和目的基因比值，就可以半定量分析目的cDNA的量了。
real-time PCR，我们最常用的一种PCR，可以定性定量的得出目的基因表达情况。总体步骤包括：RNA提取，逆转录为cDNA, cDNA荧光PCR。其中cDNA荧光PCR的意思就是cDNA扩增的时候需要各种碱基（ATCG），碱基来源于做这个实验用的试剂盒，碱基上带有荧光标记，所以新形成的DNA会带荧光标记。机器通过检测荧光淬灭检测到底经过多少次的指数倍增，cDNA达到了某一特定水平（即基线值）。举一个类似的例子，A基因原本有2；B基因有8，基线值64.经过第一轮PCR，A变4，B变16.第二轮A8，B32。第三轮A16，B64.B经过3轮PCR已经到达基线值，而A总共要经过5轮。轮数就是实验中的CT值，因此CT值越大，就说明经过的PCR次数越多，这个基因最初的量也就越小。机器跑完了整个过程之后会给出一张扩增曲线的图，和每个副孔的CT值等数据，通过一波有关CT值的计算，就可以得到梦寐以求的数据啦。
（Fig.1-扩增曲线）
这就是扩增曲线，如果设基线是600，那么第一个基因的CT值大概是14，后几个分别是17，21，24，28（曲线和基线交点的横坐标）。
2.引物的设计
引物的科学含义可以自行百度，一个简单的比喻就是唱歌的时候起的一个头。引物必然是特异性的，所以它们的设计不理想会导致后续实验失败。设计引物有以下几种方法：
1、抄袭大法：如果课题组/所在实验室有好的引物序列，直接抄；第二种抄袭就是从文献里拉出来，再去primer blast里验证。（此方法有风险，嗯，除了已经用过的确保可靠无误的引物，其他的方法都有风险= =）
2、请公司设计：生工可以免费设计，其他公司必然也有免费/付费设计，具体不详。
3、NCBI挑选：
NCBI-把数据库改成Gene-输入基因名词-Search
选择基因的种属-human/ house mouse/horse…
选择完基因后点击进入-下拉下拉再下拉-mRNA and protein(s)-NM_nnnnnnn点击进入-pick primers
修改参数-max改成150.200也可以-exonjunction span改为primer must span an exon-exon junction（一个分子生物学的知识：基因有外显子和内含子，如果没有任何限定的话，cDNA和genomic DNA都会被扩增。跨内含子设计的情况下只有cDNA得以扩增，就去除了genomic DNA的干扰。）-最后在最下面get primers
最后经过至少1分钟的等待，会显示出几条备选引物。根据法则挑选出合适的引物。
挑选引物的法则如下：
1、引物长度18-27bp，不大于38bp
2、3’端碱基一般不用A，最好用T。
3、3’端避开密码子第三位
4、GC比例40%-60% ，Forward和Reverseprimers 退火温度（Tm） 55-75℃，72℃为宜，且相差不超过4℃。
5、Self complementarity0-3为理想状态；self 3′ complementarity 严格＜1/4碱基数
6、3’端不应该有超过3个连续的C或G
transcript variant是转录本的意思，具体含义可以自行百度。大多数基因都有好几个转录本，转录本越多说明这个引物越好。很多时候除了我们要的基因，这条引物还可能把其他的基因扩增出来，在products on intended target里会显示，实际上这个数据库就是电子模拟的PCR，显示的都是真实实验中可能出现的情况。如果显示出了其他基因，真实实验的时候也有可能出现此情况，溶解曲线就会出现多峰，因此尽量选择产物单一的引物。
3.实践操作tips
提RNA的tips：比较关键的一步是吸出上层水相的时候，宁少毋多，有的时候为了多提RNA，吸了中间的蛋白和下层粉红色的液体，都会导致最终结果不理想。其次在晾干RNA的时候一般在EP管底都是肉眼可见的，可以用Marker笔圈出RNA的位置，晾干的时候用marker笔垫着，管口向下倾斜，让圈出的RNA在管子的最上方，方便观察和晾干。实验变（zong）数(mei)很(shu)大(ju)，最终反转出来的cDNA可能重复了很多次用没了，所以RNA逆转录之后尽快冻在-70℃冰箱保存，以备不时只需。
cDNA的浓度范围：我接触的最新的某厂家 cDNA逆转录试剂盒产物浓度可以达到很高，具体多少记不得了，但是做PCR所需cDNA的量往往只需要300ng/ul-600ng/ul。cDNA的量有的时候也是需要试探的，毕竟600是300的二倍，浓度不同的cDNA 的CT也会有差别，通常来讲内参（一般使用GAPDH）的CT值在13-15，如果太小需要降低cDNA的浓度，而过大则说明cDNA浓度过低。目的基因的CT值千差万别，但是基本不可能像内参那么高，超出了30则一般默认CT值是不可信的。
PCR tips：PCR的精确度要求十分高，不熟练的时候作出的结果不堪入目，一个水泡量的液体都会让副孔的设置失效。所以首先应该买不挂壁的枪头，其次要设置至少3个副孔（熟练以后可以设置2个），最终还要多多练习。无论用什么牌子的试剂，一个不变的核心问题就是只要含有cDNA的这个混合液是精确的，结果就可以保证准确。什么意思呢？我用的某厂家SYBRGreen这个试剂，里面有很多试剂，成分如下表：
只要cDNA mix每个副孔里都是一样多，每孔SYBR Green Mix的量，即使加入4μl-10μl各种不精确的量都不会影响结果的精确性。
4. 疑问和解答
1.RNA，DNA OD260/280OD260/230代表什么？
RNA：OD260/280：1.9-2.1为宜，2.0位纯品；OD260/2302.0-2.4为宜，应该＞OD260/280。
DNA：OD260/280：1.8为宜；OD260/230 1.9-2.3为宜.
分析：
OD230代表其他碳源物质，如酚、糖类等
OD260代表核酸的吸收峰
OD280是蛋白质的吸收峰
RNA OD260/280<1.8，说明蛋白或其他有机物污染，可能是吸RNA水相的时候吸到了蛋白质。OD260/280>2.2，存在RNA降解，因此注意保护RNA，使用DEPC水配PBS和80%乙醇，操作的时候戴口罩，不要说话，冰上操作等等。OD260/230 <2.0，有胍盐，蛋白，乙醇等残留，晾干不足的时候容易出现此情况。
很多时候如果一两个样品的OD260/280 或OD260/230低到了1.5，硬着头皮也能用。但是如果所有样品的吸光值比值都很诡异，一定要考虑是不是试剂是假的，或者是PCR仪在走程序的时候出现了问题。实验就是一环扣一环，cDNA反转出现问题的话直接导致PCR白做。
2.扩增曲线和溶解曲线：
扩增曲线上边已经提示了，最大的意义就是看是否有曲线、副孔的精确性和CT值，如果同样颜色的曲线都是基本重合的，重复性（精确性）就很好；2条在一起，另外1条差的有些远，那就取重叠的2条曲线的结果；如果3条分布都有自己的位置，且Ct SD>0.5，则实验失败。
溶解曲线
这是一个很标准的溶解曲线，多条曲线都是这种形状并且可以融合成一条，说明产物只有一种，引物可以用。如果1、多条曲线和融合后曲线都是多峰——毫无疑问得出了多种产物，引物不合格。2、某几个副孔/单一副孔多峰——问题不大，不是原则性问题，再次重复实验的时候可能就没有了。这种情况实际上也不用有多么求真的精神哈，做实验么，有很多未知的东西，百分之一概率的失误什么的就不要花精力在这个问题的探讨上了，毕竟大局为重。
3.结果分析：
结果的Ct mean 就是这一个基因几个副孔Ct值的均值。Ct SD 是Ct值的标准差，越小的话副孔重复性越好；＞0.5的时候重复性差。delta Ct (△Ct)，是目的基因减去内参的值，但是为了得到更多的数据，可以用目的基因每个副孔减去内参Ct平均值。之后把数据拉到另一个Excel工作表方便计算。
这里涉及到一个分组的问题。想要研究某个基因的变化，那一定是和没有对研究对象进行任何处理的情况下这个基因的表达进行比较；类似地，研究肿瘤细胞/组织和正常细胞/组织中某个基因的差异也要用癌和正常相比较。下面的例子中，H就是正常的细胞，T是肿瘤细胞。首先经过简单计算得出正常细胞的△Ct mean 和肿瘤细胞目的基因的每个孔的△Ct.△△Ct是用肿瘤细胞的△Ct减去正常细胞的△Ct。比如T细胞的 A基因的三个△△Ct，就是用8.70100002…/8.722000122…/8.756000518…分别减去H细胞的A基因 △Ct mean，即10.301（计算见图，实在是难以用语言描述，请多多自行体会）
换算成2^(-△△Ct)后，虽然图中没有显示，但是H细胞的三种目的基因的2^(-△△Ct)都是1，而T细胞的三种目的基因就是图中显示的数字，即以正常细胞目的基因的表达作为1，肿瘤细胞目的基因的表达为1的几倍。
T细胞的B基因被圈出来了，可以看到它的Ct值很大，一个是37，另一个是undertermined,就是在机器设定的40个循环内都没有达到基线值，因此这个基因很可能是不在这个细胞中表达的，所以它的数据没有意义。但是PCR没有结果不代表Western Blot没有结果，如果WB结果符合预期也是可以说明问题的。
结语：辛苦总结出来的，欢迎大家收藏呦。
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