Science | 基于网络的iPSC衍生细胞筛选揭示治疗心脏瓣膜疾病的候选药物
Science | 基于网络的iPSC衍生细胞筛选揭示治疗心脏瓣膜疾病的候选药物
作者 | 李梓盟 审稿 | 董靖鑫
今天给大家介绍美国格莱斯顿研究所Deepak Srivastava研究组发表在Science上的一篇文章。绘制人类疾病中失调的基因调控网络图谱，可以用于设计治疗核心疾病的网络校正疗法，但是这种方法往往会导致偏向发现并限制有效候选药物的可能性。为此，作者开发了一种机器学习方法来寻找药物小分子，以广泛纠正在人类诱发的多能干细胞（iPSC）疾病模型中失调的基因网络，该疾病模型涉及主动脉瓣的常见心脏病。研究结果表明，最有效的治疗候选物XCT790进行的基因网络校正可广泛应用于患者来源的主动脉瓣细胞，在小鼠模型中成功预防和治疗体内的主动脉瓣疾病。通过人类iPSC技术，网络分析和机器学习技术，这种方法可能代表药物发现的有效途径。
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介绍
确定驱动人类疾病的基因调控网络，可以设计出针对核心疾病机制的疗法。然而，传统方法只能筛选治疗剂小分子对少数输出的影响，再从稀少数据中推断它们对疾病的预期疗效。原则上，通过筛选纠正基因网络核心调控元件的分子，来映射失调网络架构以阐明关键节点可以克服以上障碍。将小分子库的基因网络效应进行分类，并将化合物的作用与途径异常的疾病进行整合来进一步测试的方法受到广泛关注。然而，这些方法通常是在标准实验室细胞系中进行的，这些细胞系通常不代表在感兴趣疾病中受影响的细胞。疾病生物学通常是特定于细胞类型的，因此利用人类诱导的多能干细胞（iPSC）和基因编辑技术可以直接筛选文库，以评估人类疾病相关细胞中的基因网络校正。靶向RNA-seq方法通过对感兴趣的特定转录本进行测序，确定其对疾病网络中100-200个签名转录本的影响，从而对网络校正分子进行经济高效的高通量筛选。
杂合性功能丧失NOTCH1（N）突变会导致主动脉瓣（AV）狭窄和钙化性AV病（CAVD），这是人类心脏病的常见形式。N1是一种跨膜受体，可响应流体剪切应力而裂解，导致细胞内结构域的核易位，起转录调节剂的作用。在这项工作中，作者进行了基于网络的药物筛选以识别小分子，这些小分子纠正了来自患有AV狭窄和CAVD的患者在iPSC衍生的EC中，由N1单倍剂量不足引起的基因网络失调。顶部校正器XCT790对失调网络节点的修复作用可归纳为来自散发性CAVD患者的一组主要AVEC。此外，XCT790预防和治疗了小鼠的N1依赖性心脏瓣膜病，提供了体内验证，是药物治疗人类心脏瓣膜病的有可能的候选物。因此，基于网络的筛选可以区分对人类疾病中失调基因网络工程具有广泛修复作用的分子，从而将其转化为体内功效。
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方法
N1单倍剂量不足引起的失调基因网络图谱 为了绘制被N1单倍型不足破坏的基因网络图谱，并识别将网络改回正常状态的小分子，作者设计了一种靶向RNA-seq策略，可检测119个签名基因或修正同基因细胞的表达。相比于只有较少网络状态观察结果的先前实验，大量重复实验使得能够以更高的置信度来定位N1调控的基因网络。网络推论预测SOx7和WNT信号传导效应因子TCF4都被N1单倍剂量不足上调，可能是促成骨基因。它们在失调的网络中高度连接，而SOX7是连接度最高的第三位总体基因。与先前的扰动实验一致，BMP信号转导效应物SMAD1（也被N1单倍功能不足上调）预计在网络中更外围的地方。相互联系最紧密的基因是CSDA，它被N1单抗不足下调，并充当GM-CSF启动子（的抗炎阻遏物。内皮转录因子ETS1和ETS2也高度相关，这与细胞类型有关。
基于网络来识别用于网络校正的小分子 在绘制了由N1单倍型不足引起的失调网络关键调节节点之后，作者使用机器学习方法筛选了一些小分子，这些小分子可以将网络改正为正常状态。作者训练了K近邻（KNN）算法，根据暴露于DMSO的每种基因型的同基因EC，通过有针对性的RNA-seq将网络基因表达按WT或NI +分）.KNN算法通过留一交叉验证将EC分为WwT或NI +/-，准确度达到99.3％。当映射到两个主要成分时，被错误分类为WT的单个NI +/- EC复制出现在两个类别的边界附近。
当将训练好的KNN算法应用在暴露于1595个小分子中的每一个NT +/- EC时，绝大多数仍归为NI +/-。但是，有11种分子可以充分纠正网络基因的表达，从而使处理过的NI + -ECs归类为WT（图1C）。为了增强用于选择初始候选对象的算法多样性，作者还使用了完整的团聚方法，使经过处理的N1-单倍型EC与WTEC聚集在一起（图1D）。通过上述方法鉴定出的有希望的候选物中，有八种化合物足以纠正网络基因表达（图1E）。当绘制在两个主要成分上时，经验证的分子处理的N1单倍体不足ECs与未经验证的分子处理的ECs更接近于WT ECs（图1C）。验证过的分子包括预计会抑制成骨的化合物（XCT790）和动脉粥样硬化的化合物（TGO03，GSK837149A），这两种化合物都可能影响CAVD。总体而言，基于网络的筛选方法确定了对失调基因网络具有广泛恢复性影响的分子。
网络校正分子（最主要是XCT790）使异常路径正常化 接下来，作者一式三份进行整个转录组RNA-seq，以确定每个确定的网络校正小分子对整个转录景观的影响（图2A）。作者将Fmoc-leu用作阴性对照，该分子可在初始筛选中促进NI +/- ECs归类为WT。试验结果表明， XCT790处理的ECs与WT ECs的转录谱密切相关（图2A）。
考虑到SOX7和TCF4在N1单倍蛋白充足性失调的网络中作为中央调控节点的预测作用，对这些节点的校正将对整个网络具有广泛的修复作用。实际上，直接靶向这些节点的siRNA可以将N1单倍体不足EC中的上调和下调基因广泛地恢复到正常状态（图2B）。与此相对应的是，对这些调控节点修复效果最强的XCT790化合物驱使N1单倍型不足的EC与WTEC最紧密地相关，最大程度地校正了最大数量的基因（图.2B和C）。因此，通过XCT790纠正中央调节节点sOx7和TCF4表达的化学处理，似乎在恢复整个网络方面最有效。
xCT790可恢复散发性CAVD患者原代AV细胞失调的途径 由于XCT790的治疗足以使Nit-withwTiPSC来源的EC聚类，因此作者测试了XCT790的效果是否可以推广到多位散发CAVD患者的原发性AV EC。实验结果表明，CT790可有效地将原cTAV和cBAV ECs（分别为基因的71％和69％）的异常调节基因恢复到正常状态，分别包括EGFR信号，剪切响应和细胞周期基因（图3A和C）。总体而言，N1单倍体不足EC中的基因表达失调与cTAV EC和cBAV EC中相同方向的失调存在明显重叠（图3D）.N1在cBAV EC中显着上调，可能反映了对网络下游区域主要缺陷的代偿性反应，通过XCT790处理可明显缓解。但是，在cTAV和cBAV EC中，NOTCH2均显着下调，但XCT790也将其校正为正常水平。类似地，N1-单倍性不足的iPSC衍生的EC，SOX7和TCF4 在cBAV ECs中显着上调，在cTAV ECs中呈上调趋势，并通过XCT790校正为正常（图3E）。SMAD1在cTAV和cBAV ECs中SMAD1均显着上调，并且通过XCT790也校正为正常（ 图3E）。
网络校正分子可减少体内AV疾病 为了确定已鉴定的网络校正分子，是否足以预防由N1单体不足引起的心脏瓣膜疾病，作者在NIt /-小鼠中进行了临床前试验，总共测试了6种8个化合物，以Fmoc-leu作为阴性对照。TGO03和XCT790在AV峰速度的初步研究中显示出令人鼓舞的结果，因此在第二组中重复了该研究。TGO03趋于改善，但最终并未影响疾病的进展，在试验剂量下具有统计学意义。相反，通过体外超声心动图，XCT790在体外最有效地恢复了失调的基因网络，足以防止AV峰速度增加（图4A），它还显示出降低PV峰值速度的趋势。当用XCT79o治疗在1个月大时AV峰速度增加和整个瓣膜的血压梯度升高的小鼠子集时，观察到治疗一个月内某些小鼠的进展停止甚至逆转（（图4C）。XCT790还显着降低了经治疗的AVs和PVs的厚度（图4D ，E）。治疗一个月后，XCT790显示59％的发生钙化的人有降低风险的趋势（图4F），而有钙化的人中，钙化程度降低了91％（图4，G H）。此外，XCT790治疗显着降低了表达成骨细胞转录调节因子RUNX2的AV细胞的百分比，表明CAVD的成骨转换降低（图4I）。除此之外，XCT790在其他实验中也显著表明它的有效作用。
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总结
这项工作代表了在人类疾病相关的iPsC衍生细胞中基于广泛基因网络的药物筛选，该筛选在一系列原代人类细胞和小鼠模型中得到了验证，从而确定了可治愈人类心脏病的潜在治疗分子。利用靶向RNA测序技术和机器学习技术，可以对疾病网络中众多特征基因上的将近1600个小分子进行有效的询问。此外，验证分子XCT790恢复了非家族性CAVD患者瓣膜培养的原发性EC中关键失调节点，从而验证了iPSC衍生的EC模型的使用并证明了研究结果可扩展至散发病例。最后，对使用人iPSC衍生的EC发现分子进行的体内测试表明，XCT790是体外最有效的网络校正分子，足以预防和治疗该疾病小鼠模型中的CAVD。
参考资料
Christina V. Theodoris, et al. Network-based screen in iPSC-derived cells reveals therapeutic candidate for heart valve disease. Science, 2020.
DOI：10.1126/science.abd0724