Cell｜结构生物学的基本挑战：结构很美，但不一定对

智药邦

发布于 2024-03-05 17:43:29

1090

发布于 2024-03-05 17:43:29

文章被收录于专栏：智药邦智药邦

2024年2月1日，Cell发表文章Structure is beauty, but not always truth。

结构生物学虽然功能强大，但也可能会产生误导。本文强调了结构生物学的四个基本挑战：解释原始实验数据；考虑运动；解决体外结构的误导性；揭示药物与非靶点之间的相互作用。克服这些挑战将能够扩大结构生物学对药物发现的影响。

背景

结构可以帮助解决药物设计中的许多关键难题。低温电子显微镜（cryo-EM）、X射线晶体学和核磁共振（NMR）所产生的原子模型为我们提供了一个强有力的起点，让我们可以通过识别结合口袋和潜在的异构位点，对如何调节蛋白质功能进行广泛而富有创造性的思考。配体结合结构将化学空间的搜索重点极大地集中在与受体保持关键相互作用的分子上。

通过提供"真实结构"，结构生物学是清晰、可量化和可解释的。在最好的情况下，每个原子的精确位置都是明确的。例如，通过测量配体和受体上原子间的距离，我们可以推断出"这个氢键比那个氢键更好"。相比之下，靶点的生物学特性往往相当复杂，难以建立定量模型。细胞化验和动物模型都是近似值，不能完全再现人类疾病过程或小分子诱导毒性的可能性。此外，药物化学充满了不确定性。即使有了一个结构，在抑制剂优化过程中，也很难知道下一步要制造什么分子或如何合成。最后，我们很难理解为什么有些分子比其他分子更有效或生物利用度更高，因此几乎不可能优化候选药物的药代动力学和安全性。

然而，结构生物学的"真相"引起了人们的合理担忧：结构信息（如蛋白质晶体结构）的可用性是否会造成不可弥补的限制？对于那些没有认识到结构和新预测方法的内在局限性的人来说，这是一个潜在的风险。

结构生物学和药物发现的四个残酷事实

结构是模型，不是实验现实

毫无疑问，AlphaFold2"解决"了蛋白质结构预测问题，从而震动了结构生物学领域。所谓"解决"，是指根据CASP竞赛所使用的指标，预测的模型与实验确定的"真实结构"结构高度相似。值得注意的是，真实结构包含的不准确性超出了生成这些结构的实验的信噪比。

例如，在 X 射线晶体学中，实验数据的测量非常精确（通常误差小于 5%），但根据这些数据提炼出的结构与实验数据相比却有很大的残余误差（一般>～20%）。因此，"真实"可能不仅仅在于与原子坐标的比较，尤其是当结构基于低分辨率数据时。相反，与密度图（甚至原始衍射图像或显微照片）的比较可能会揭示更深层次的真相（图1）。

图1 结构生物学数据流中的信息损失

最近的一项工作直接将AlphaFold2模型与实验晶体密度图进行比较。根据实验数据对AlphaFold2模型进行细化，可以解决一些全局尺度失真和结构域定向问题，还能改善局部骨架和侧链的构象的预测水平。然而，大多数高置信度预测结果与实验图的差异程度要大于独立确定的实验结构。

这些发现促使我们思考如何在药物发现中最大限度地利用计算预测模型。预测模型与实验结构（甚至是基础数据）之间的一些差异可能反映了对蛋白质构象能量图谱中较少探索的部分的偏倚。此外，将预测模型暴露于正交计算技术（如长分子动力学模拟）的价值目前还不清楚。尽管有这些顾虑，AlphaFold2和相关方法已经在药物发现领域产生了巨大影响，从通常被认为是平凡的领域（如DNA构建设计）到被广泛认为是令人兴奋的领域（如将配体放入预测结合口袋的生成人工智能建模）。

因此，计算预测模型在减少药物发现早期阶段的不确定性方面具有巨大潜力，而这通常发生在得到确定的结构之前。AlphaFold代码库的发布引发了结构生物信息学的“寒武纪大爆炸”和意想不到的发现（例如，利用AlphaFold Multimer预测蛋白质复合物）。然而，令人不安的是，AlphaFold的下一阶段发展充满了不确定性，因为方法的公开已从预印本、GitHub和期刊转向了没有附带方法的公司博客文章。如果没有公开的方法，我们就很难判断结构预测的准确性是否正在接近稳定期。当达到这样的稳定期时，我们需要知道有多少是由于"真实结构"的错误定义造成的。要进一步提高结构预测的准确性，很可能需要针对实验数据（而不是精炼结构）进行更直接的训练。此外，认识到结构是实验数据的模型，而实验数据实际上代表了许多（移动的）分子的平均值，这可能会释放出新的能力。

表征扭动和摆动很难

费曼说："生物所做的一切都可以用原子的抖动和摆动来理解。"这句话蕴含着深刻的智慧，表明我们需要对真实结构进行全面的重新定义。我们可以解释对药物发现至关重要的大分子运动，并重塑我们的视角，以解释生物分子的动态性质和集合体的存在。

对于基于结构的药物设计而言，少数蛋白质非常简单，基本上可以认为是静态的。然而，即使是简单的侧链运动，目前也很难预测。这就揭示了一个重要的原因：在药物发现活动中，无论配体是否被视为类药，都需要与任何种类的配体快速形成共复合物。敲击蛋白质表面的壁也是寻找替代结合位点和隐秘口袋的有效方法。这种策略可以引导研究小组制造出根本不适合静态结合口袋的化合物，但却能与之结合，从而揭示受体的内在动态。

即使认识到单一结构可能具有误导性，让当前的人工智能方法意识到多重真相并生成概率集合仍然是一项前沿挑战。当前的生成模型可以从潜在空间生成结构，而潜在空间可能与系统的底层能量景观有关。就像一个世纪前物理学从经典力学到量子力学的转变一样，对蛋白质构象景观的更多概率观点很可能会解释单个结构无法解释的特性。

然而，目前的模拟方法很难应用，因为所得到的状态往往很罕见，而且相互转换的速度很慢。完善与实验数据更一致的集合可能会为单结构和集合预测的下一次突破提供基础。与基于结构的药物设计在优化"表面互补性"和静电方面的巨大作用类似，未来的蛋白质建模方法将开启基于集合的药物设计，并能对设计的新的重要方面进行可预测的调整，包括结合配体的熵贡献和停留时间。

体外实验具有欺骗性

虽然脱离细胞环境纯化蛋白质有助于体外药物发现，但也可能造成假象。重组表达可能会导致翻译后修饰（如磷酸化或糖基化）的缺失，而这些修饰对于了解蛋白质的功能至关重要。AlphaFold2预测最令人兴奋的发现之一是，该模型能够以某种方式"感知"原生环境的某些部分，而纯粹基于物理的预测会遗漏这些部分。预测的结构可以填充修复基团（如血红素）、金属和代谢物，因此只需极少的改进就能将它们"移植"到模型中。

新兴技术，尤其是低温电子断层扫描（cryo-ET）技术，具有直接从细胞中的观察结果提供原子论见解的巨大潜力。这样，结构生物学对药物发现的适用性和相关性无疑会增加。

药物与许多不同的受体混合

所有药物发现者都必须面对的一个可悲现实是，无论我们认为我们的化合物设计得多么完美，它们都会想方设法与人体内的许多其他蛋白质或核酸相互作用，干扰这些生物大分子的正常功能。这种多药理作用更有可能产生不良后果。这些不良后果有两种形式：直接与非靶点结合会导致一系列令人困惑的毒性；与非靶点结合会降低药物到达所需靶点的能力。

药物与酶、转运体、通道和受体之间的相互作用是一项特殊的挑战，这些酶、转运体、通道和受体在很大程度上负责控制药物的代谢和药代动力学特性（DMPK），即药物的吸收、分布、代谢和消除。药物通常会与血浆蛋白结合，阻止它们到达预定的组织；它们会阻断各种泵和转运体或成为它们的底物，从而改变它们在体内的分布；它们偶尔会干扰异生物传感器（如 PXR）；它们通常会阻断细胞色素P450s等酶，从而改变它们自身和其他药物的代谢。

可以将这些与DMPK相关的蛋白质统称为"避免组"（图 2）。遗憾的是，绝大多数避免组靶点的结构尚未确定。此外，这些蛋白质中有许多是复杂的机器，包含多个结构域，并表现出相当大的结构动态性。它们的结合口袋可能相当大而且杂乱无章，即使是密切相关的化合物也会有不同的结合模式。因此，要充分了解如何以最佳方式防止药物与这些有问题的非靶点结合，就需要跨越一系列结合配体和蛋白质构象状态的多种结构。