scRNA|R版CytoTRACE v2从0开始完成单细胞分化潜能预测

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发布于 2024-04-26 11:15:54

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发布于 2024-04-26 11:15:54

CytoTRACE v2 在2024.03月发表在预印本Mapping single-cell developmental potential in health and disease with interpretable deep learning。V2 使用可解释性的AI算法来预测单细胞RNA测序数据的细胞分化潜能。除了给出从0（分化）到1（全能）的连续发育潜能度量结果外，还根据细胞的发育潜能进行分为6类：具有广泛分化潜能的全能(totipotent)和多能(pluripotent)干细胞，到能够产生不同数量的下游细胞类型的 谱系限制性多能细胞（lineage-restricted oligopotent），多能(multipotent)和单能(unipotent)细胞，再到最终的 分化（differentiated）细胞。

相较V1的功能和理论的改进详见文献正文，在代码实现上CytoTRACE v2中拆分为了R版本和Python版本，安装R版本的话无需配置python的环境，使用门槛大幅降低。

一载入R包，数据

1，R包安装及解决报错

根据https://github.com/digitalcytometry/cytotrace2?tab=readme-ov-file中的方式进行安装

（1）使用devtools::install_github直接安装

devtools::install_github("digitalcytometry/cytotrace2", subdir = "cytotrace2_r") 
library(CytoTRACE2)

# 出现报错
Using github PAT from envvar GITHUB_TOKEN
Downloading GitHub repo digitalcytometry/cytotrace2@HEAD
Error in utils::download.file(url, path, method = method, quiet = quiet,  : 
  download from 'https://api.github.com/repos/digitalcytometry/cytotrace2/tarball/HEAD' failed

（2）如果出现上述的报错，这时候只要将报错内容的“https://api.github.com/repos/digitalcytometry/cytotrace2/tarball/HEAD” 复制到网址搜索栏回车，就会下载一个文件tar.gz的压缩文件，然后我们再本地安装即可。

# 本地安装
remotes::install_local("./digitalcytometry-cytotrace2-6fe2bad.tar.gz",
                       subdir = "cytotrace2_r", # 特殊的
                       upgrade = F,dependencies = T)
library(CytoTRACE2)
library(tidyverse)
library(Seurat)

注：打开tar.gz压缩包可以看到作者分的python 和r 版本，所以这里需要使用subdir参数指定为cytotrace2_r 。

注：其他的github包出现类型报错也可以使用上述方式进行解决，一般不需要设置subdir 。

2，准备单细胞数据

然后使用之前注释过的sce.anno.RData数据，为节省资源，每种细胞类型随机抽取30%的数据。

load("sce.anno.RData")
sce2@meta.data$CB <- rownames(sce2@meta.data)
sample_CB <- sce2@meta.data %>% 
  group_by(celltype) %>% 
  sample_frac(0.3)
sce3 <- subset(sce2,CB %in% sample_CB$CB) 
sce3
# An object of class Seurat

二 CytoTRACE v2 分析

1，CytoTRACE v2 分析

该版本可以接受单细胞对象 或者 单细胞矩阵的两种形式，物种可以是人或者小鼠（默认）。本推文是使用人的单细胞对象（sce3）进行cytotrace2分析的示例。

#######输入seurat 对象###########
cytotrace2_result_sce <- cytotrace2(sce3, 
                                is_seurat = TRUE, 
                                slot_type = "counts", 
                                species = 'human',
                                seed = 1234)
cytotrace2_result_sce

An object of class Seurat 
51911 features across 4202 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (51911 features, 2000 variable features)
 4 dimensional reductions calculated: pca, umap, tsne, harmony

输入的是单细胞对象，得到的也是单细胞对象，且meta信息中包含了相关score的结果。

其中CytoTRACE2_Relative为score的具体数值结果；CytoTRACE2_Potency为文章开头提到的的六类结果。

注1：cytotrace2默认的是小鼠，所以需要指定species = 'human' ；如果是单细胞对象的话需要指定is_seurat = TRUE ；指定seed 方便后续的结果复现。。

2，CytoTRACE v2可视化

（1）v2在 plotData

同cytotrace v1的可视化函数不一样，v2在 plotData函数中包装了一些常见的可视化结果，可以先设定待展示的表型（celltype） 。

# making an annotation dataframe that matches input requirements for plotData function
annotation <- data.frame(phenotype = sce3@meta.data$celltype) %>% 
  set_rownames(., colnames(sce3))

# plotting
plots <- plotData(cytotrace2_result = cytotrace2_result_sce, 
                  annotation = annotation, 
                  is_seurat = TRUE)
# 绘制CytoTRACE2_Potency的umap图
p1 <- plots$CytoTRACE2_UMAP
# 绘制CytoTRACE2_Potency的umap图
p2 <- plots$CytoTRACE2_Potency_UMAP
# 绘制CytoTRACE2_Relative的umap图 ，v1 
p3 <- plots$CytoTRACE2_Relative_UMAP 
# 绘制各细胞类型CytoTRACE2_Score的箱线图
p4 <- plots$CytoTRACE2_Boxplot_byPheno

(p1+p2+p3+p4) + plot_layout(ncol = 2)

（2）调整出图的风格，与V1接近（plotData函数中的代码）

FeaturePlot(cytotrace2_result_sce, "CytoTRACE2_Relative",pt.size = 1.5) + 
  scale_colour_gradientn(colours = 
                           (c("#9E0142", "#F46D43", "#FEE08B", "#E6F598", 
                                      "#66C2A5", "#5E4FA2")), 
                         na.value = "transparent", 
                         limits = c(0, 1), 
                         breaks = seq(0, 1, by = 0.2), 
                         labels = c("0.0 (More diff.)", 
                                    "0.2", "0.4", "0.6", "0.8", "1.0 (Less diff.)"), 
                         name = "Relative\norder \n", 
                         guide = guide_colorbar(frame.colour = "black", 
                                                ticks.colour = "black")) + 
  ggtitle("CytoTRACE 2") + 
  xlab("UMAP1") + ylab("UMAP2") + 
  theme(legend.text = element_text(size = 10), 
        legend.title = element_text(size = 12), 
        axis.text = element_text(size = 12), 
        axis.title = element_text(size = 12), 
        plot.title = element_text(size = 12, 
                                  face = "bold", hjust = 0.5, 
                                  margin = margin(b = 20))) + 
  theme(aspect.ratio = 1)

单细胞的很多可视化都是可以使用ggplot2进行自定义的。更多ggplot2 的调整可以参考ggplot2 | 关于标题，坐标轴和图例的细节修改，你可能想了解,ggplot2|详解八大基本绘图要素,ggplot2|theme主题设置，详解绘图优化-“精雕细琢” 等。

（3）细胞类型-箱线图

除了p4自带的箱线图，也可以根据需求自行绘制 scRNA分析|使用AddModuleScore 和 AUcell进行基因集打分，可视化

library(ggpubr)
p1 <- ggboxplot(cytotrace2_result_sce@meta.data, x="celltype", y="CytoTRACE2_Score", width = 0.6, 
                color = "black",#轮廓颜色
                fill="celltype",#填充
                palette = "npg",
                xlab = F, #不显示x轴的标签
                bxp.errorbar=T,#显示误差条
                bxp.errorbar.width=0.5, #误差条大小
                size=1, #箱型图边线的粗细
                outlier.shape=NA, #不显示outlier
                legend = "right") #图例放右边 
###指定组比较
my_comparisons <- list(c("Epi", "un"), c("T", "un"),c("Myeloid", "un"))
p1+stat_compare_means(comparisons = my_comparisons,
                      method = "wilcox.test")