bismark 识别甲基化位点
在bismark中，根据甲基化的C所处的上下文环境，分成以下3类；
- CpG
- CHG
- CHH
p代表磷酸二酯键，CpG指的是甲基化的C的下游是1个G碱基。H代表除了G碱基之外的其他碱基，即A, C, T中的任意一种，CHG代表甲基化的C下游的2个碱基是H和G, CHH表示甲基化的C下游的两个碱基都是H。
bismark 比对完之后，会生成1个bam 文件。使用bismark_methylation_extractor命令可以从bam 文件中识别到甲基化的C，命令如下
bismark_methylation_extractor —comprehensive test/test_data_bismark_bt2.bam
只有1个参数，这个bam 文件是bimark比对生成的bam文件，每个样本一个bam文件。
默认情况下，软件会自动根据两个因素生成结果文件
- 甲基化的C的类型
就是前面提到的
CpG,CHG,CHH3种类型 - 比对情况
包括比对到四条链上
OT,OB,CTOT,CTOB4种情况 所以会生成 3 X 4 = 12 个文件，对于链特异性文库来说，会生成3 X 2 = 6 个文件，这6个文件内容是类似的，都是记录了甲基化的C的染色体位置。
comprehensive选项的作用就是在生成最终文件时，只考虑3种甲基化类型，将所有的比对情况进行合并，这样最终只会生成3个文件.
CpG_context_test_data_bismark_bt2.txt CHG_context_test_data_bismark_bt2.txt CHH_context_test_data_bismark_bt2.txt
以CpG_context_test_data_bismark_bt2.txt为例，内容如下：
Bismark methylation extractor version v0.19.0 SRR15024317_length=86 - 1 57798691 z SRR15024319_length=86 + 2 10166600 Z SRR15024331_length=86 + 11 77736289 Z SRR15024338_length=86 + 3 197272186 Z
共5列，第一列为比对上的序列ID，第二列为基因组的正负链信息，第三列为染色体编号，第四列染色体上的位置，第5列为甲基化的C的状态。
不同字母表示不同的甲基化C:
X 代表CHG中甲基化的C x 代笔CHG中非甲基化的C H 代表CHH中甲基化的C h 代表CHH中非甲基化的C Z 代表CpG中甲基化的C z 代表CpG中非甲基化的C U 代表其他情况的甲基化C(CN或者CHN) u 代表其他情况的非甲基化C (CN或者CHN)
对于CpG, 采用字母X的大小写来表征甲基化状态；对于CHG, 采用字母H的大小写来表征甲基化状态；对于CHH, 采用字母Z 的大小写来表征甲基化状态。
上面的文件是methylation calling 最直接的证据，但是对于甲基化水平的定量来说，缺少了相关信息。运行bismark_methylation_extractor时，除了生成上述文件之外，还会有下列3个文件
test_data_bismark_bt2_splitting_report.txt test_data_bismark_bt2.M-bias.txt test_data_bismark_bt2.M-bias_R1.png
test_data_bismark_bt2_splitting_report.txt
记录了该样本甲基化的汇总信息
Final Cytosine Methylation Report Total number of C’s analysed: 40348 Total methylated C’s in CpG context: 1365 Total methylated C’s in CHG context: 21 Total methylated C’s in CHH context: 103 Total C to T conversions in CpG context: 678 Total C to T conversions in CHG context: 10076 Total C to T conversions in CHH context: 28105 C methylated in CpG context: 66.8% C methylated in CHG context: 0.2% C methylated in CHH context: 0.4%
test_data_bismark_bt2.M-bias.txt
定义了每一个甲基化位点的详细信息，%methylation就是我们定量常用的beta 值
部分文件内容如下
CpG context position count methylated count unmethylated % methylation coverage 1 42 13 76.36 55 2 31 9 77.50 40
test_data_bismark_bt2.M-bias_R1.png
双坐标轴图，左侧的纵轴代表甲基化比例，右侧的纵轴代表甲基化的数目，横坐标代表测序读长。