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今天和大家分享的是2020年1月发表在AGING（IF：4.831）上的一篇文章，“Prediction of hepatocellular carcinoma prognosis based on expression of an immune-related gene set”，作者结合多因素cox回归分析，ssGSEA富集分析等方法开发了基于免疫的HCC预后预测模型（IPSHCC），并用4个训练集对模型的准确性进行验证；此外，作者还将IPSHCC模型与年龄、分期等临床特征相整合，使其预后价值进一步增强。
Prediction of hepatocellular carcinoma prognosis based on expression of an immune-related gene set
基于免疫相关基因表达的肝细胞癌预后预测
一、研究背景
HCC是世界上最常见恶性肿瘤之一，发展迅速，治疗困难。大多数HCC患者诊断为晚期疾病，并伴有门静脉肿瘤血栓等疾病，导致预后极差。因此，晚期HCC需要4新的预测方法来提高总生存率；越来越多的证据表明，免疫相关基因的表达可能与肿瘤预后有关，基于这些基因的预后标记可能有助于确定HCC患者的有效治疗方法。所以作者希望通过建立基于免疫相关基因的新模型来有效预测HCC患者的预后、评估疾病状态和确定治疗方案。
二、分析流程
三、结果解读
1、IPSHCC模型的构建
- 作者取来自5个独立数据集的共903例HCC患者样本纳入IPSHCC分析中，其中308例样本作为训练集，其余样本本别属于4个验证集（补表1）
补表1.数据集来源列表
- 取训练集中与HCC患者预后生存率有关的272个基因，进行ssGSEA分析，确定HCC患者中每种免疫类型的富集分数（流程如图1）
图1.建立和验证IPSHCC模型的流程图
- 对多种免疫类型进行的多因素cox回归分析，得到每种免疫类型在模型中对应的相关系数，也就完成了IPSHCC模型的初步构建（表1）
表1.多因素cox得模型中免疫类型对应系数
2、IPSHCC模型的验证
- 首先，作者按照训练集中患者的免疫类型平均系数值（-0.0087）作为cut-off，把训练集和四个验证集分为高、低免疫风险组，对IPSHCC模型与患者预后生存率进行荟萃分析，结果显示高免疫风险组的生存率比低免疫风险组要低2.6416倍。（表2）
表2.高低免疫风险组IPSHCC预测结果比较
- 接着，为了进一步印证IPSHCC模型的预后价值，作者对训练集和4个验证集分别进行了高、低免疫风险组的KM生存分析，结果一致显示：“IPSHCC低免疫风险组”的中位OS高于“IPSHCC高免疫风险组” 同时，作者还对IPSHCC模型的预测结果绘制了ROC曲线，5个数据集的AUC值反映了该模型具有较强的预测水平（其中训练集和验证集1、2、4、5的1年、3年、5年AUC值均>0.65） （图2）
图2.KM生存分析及ROC曲线图
- 图3.B中作者给出了IPSHCC在总数据集中的分布，其中上面部分显示的是IPSHCC分布与患者生存状况的对应关系；而下半部分给出的是15中免疫类型的富集分数对应患者生存状况的热图（图3.B）
图3.总数据集IPSHCC对应生存状态的分布
3、IPSHCC模型的临床亚组和敏感性分析
- 首先，对IPSHCC与年龄、性别、分期、有无侵袭做多因素cox分析，发现IPSHCC模型在所有临床亚组中均具有显著的预后相关性，结果提示了此模型的预后机制可能独立于其他临床特征（补图1）
补图1.IPSHCC与其他临床预后因素的多因素cox
- 此外，作者鉴定了196个与免疫相关的基因样本，列出了它们中包含的免疫过程，如表3所示。 作者使用ssGSEA富集分析，基于IPSHCC模型中的免疫类型对应系数，计算出占比最高的3种免疫类型（antimicrobials、cytokines、cytokine_receptors）的免疫评分，采用KM生存分析比较了高、低免疫评分组的中位OS值，发现高评分组预后更为良好。（图4.A）
表3.免疫类型各自占比列表
- 在以上基础上，作者进一步补充验证IPSHCC模型的预测稳定性，从合并数据集中随机采500样本10000次，绘制全部采样结果的p值和C指数（用于评价模型预测能力，取值0.5-1时有意义）的直方图，发现p值全部小于0.05，C指数中位数为0.6819，表明该模型具有较强的预测水平（图4.B、C）
图4.利用C-index验证模型的预测水平
4、信号通路富集分析
- 作者对196个免疫相关基因进行富集分析：KEGG分析显示出69个相关通路（包括PI3K/AKT通路等），GO分析确定了205个生物学过程、57个分子功能、30个细胞组成相关的通路。
5、IPSHCC模型与其他预后影响因素的预测能力比较
- 作者使用单因素cox分析比较了5种其他疾病预后影响因素的预测水平，将包括IPSHCC模型在内的10个预后预测因子的P值和C指数进行排序（表4），表4结果显示：IPSHCC的p值最低，C指数最高，表明其具有较强的预测价值 同时作者绘制了10个预测因子P值和C指数进行可视化，更清晰地反映了以上结论（图5）
表4.单因素cox比较IPSHCC模型与其他预后因素的预测水平
图5.表4中p值和C指数的可视化
6、IPSHCC模型的改良——与临床特征相整合
- 年龄、性别、分期和侵袭程度是重要且独立的HCC预后影响因素，所以作者试图将训练集多因素cox得到的系数与IPSHCC模型相整合，具体公式为：integrated model = 0.776924010 × IPSHCC + 0.004843653 × age + 0.625080315 × stage + 0.061769897 × gender -0.319739104 × invasion
- 接着，作者将整合后的模型与原模型的预测能力进行比较（分别在训练集和HCCDB18验证集中进行），给出了二者的RMS（限制性平均生存时间）曲线图，发现在训练集和验证集中得到的结果均显示整合后的模型的C指数高于原模型，说明作者的改良方式显著提高了模型的预测水平（图6）
图6.RMS曲线图评估整合后模型的预测水平
小结
本篇文章中作者利用903例HCC患者数据集构成了一个训练集和四个验证集，通过ssGSEA富集分析、多因素cox分析、KM生存分析、meta分析等方式建立并验证了一个基于免疫相关基因表达的HCC患者预后预测 （IPSHCC）模型。四个验证集的验证使该模型的稳定性更有保证，同时作者还将模型与其他临床预后因素整合，进一步加强了模型的预测能力。