单细胞组学-scATAC建库原理及应用
原创单细胞组学-scATAC建库原理及应用
原创
摘要
普通ATAC建库及scATAC建库流程解析及应用
普通ATAC建库
建库流程
ATAC-Seq是“Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput Sequencing“的缩写，使用高通量测序 (ATAC-seq) 检测转座酶可及染色质是在全基因组水平上揭示染色质可及性的有效方法。通过 ATAC-seq，来自少数细胞的读数反映了与核小体定位和转录因子结合位点相对应的可及性区域，并使用生物信息学绘制转录因子及核小体位置的结合区域。
通常建库的流程主要分为三个步骤：细胞裂解、转座及扩增（Buenrostro JD et al, 2015）。
细胞裂解
首先，将用于测序的的组织或细胞样本在裂解缓冲液中制备成完整的单细胞悬液（图a）（Sun Y et al, 2019;Lu Z et al, 2017）。
转座反应
重悬细胞核悬液，在转座反应混合物中孵育以产生 DNA 片段，加入Tn5转座酶标记基因组DNA（图c）(Sun Y et al, 2019)。
PCR扩增
将转座后的 DNA 扩增用以生成用于测序的文库（图b）。
sc-ATAC建库
建库流程
scATAC-seq作为ATAC-seq的升级版，可以在单细胞的水平上明确细胞分化过程开放性染色质有什么差异，调控了哪些信号通路等等。
通常建库流程主要分为5步：核裂解、转座、单细胞标记、标记后孵育及文库构建（10X官网）。
细胞核裂解
目前10X官网上有一些人类及小鼠组织的提核方案，但是针对于植物的方案较少，因此做植物的人还是需要查阅大量的文献去对应自己研究的组织部位，获得适宜于该研究的buffer，来进行后续的研究。
与普通ATAC一样，细胞核裂解可以选用buffer直接裂解和流式分选获得单个细胞核，如其他的一些方法（LCM，磁珠吸附），但相对于细胞核的通量较低。
转座
细胞核悬浮液中加入含有Tn5转座酶的混合液，随后开始进行孵育。孵育中转座酶进入细胞核，与染色质开放区进行结合，将 DNA 片段化。同时，将接头序列结合到 DNA 片段的末端。
单细胞标记
单细胞ATAC组学与普通ATAC组学主要的区别是在建库的时候对每个细胞进行标记建库，随后进行文库构建，在进行后续分析时可以获得单个细胞的染色质可及性水平。
因此在进行单细胞标记时会给每个细胞带上一种磁珠（barcode），给每种细胞进行定性及定量。
标记后孵育
选用硅烷磁珠用于去除GEM反应后混合物中残留物，同时选用SPRI磁珠用于吸附样品中没有结合的barcode。
文库构建
按照10X官网上推荐的构建文库的PCR体系，加入P7和引物，循环扩增后获得ATAC文库，将最终的文库进行测序。
应用
scATAC在植物上的应用（Marand AP et al, 2021）
研究人员通过对玉米的6个不同的组织（包括腋芽、雄蕊，雌蕊花序、幼苗、胚根尖、胚后冠根）进行单细胞染色质可及性分析，获得了玉米的大部分组织的染色质图谱，随后选用原位杂交实验对结果进行验证；同时鉴定了顺式调控元件在不同细胞类型和发育时期的调控变异，完善了CREs调控基因表达的机制。
scATAC在疾病上的应用（Liedtke M et al，2019）
研究人员通过整合多个单细胞组学（蛋白质定量、转录组分析和染色质可及性分析），建立了健康血液发育的正常表观遗传图谱，然后将其用于消除混合表型急性白血病患者血液中异常分子特征的积累。由于不同患者之间存在较大的表观遗传异质性，但研究人员依然发现到了患者之间常见的恶性表征及患者表型间共有的特异性调节特征。通过转录组和染色质可及性分析确定了91601个潜在的peak-to-gene连锁和调控白血病特异性基因的转录因子，例如与标记基因CD69邻近的RUNX1连锁调控元件。这些结果表明，在正常发育情况内对单个细胞进行多组学分析可以揭示患者的疾病独特和共享分子机制。
scATAC在细胞发育与分化的应用（Jia G et al，2018）
研究人员使用单细胞 RNA 测序和转座酶可及染色质分析 (ATAC-seq) 全面表征了从 E7.5 到 E9.5 的由 Nkx2-5 和 Isl1 表达标记的小鼠心脏祖细胞 (CPC)。通过利用细胞间转录组和染色质可及性异质性，研究人员确定了不同的以前未知的心脏亚群。发育轨迹的构建表明，多能 Isl1+ CPC 在分离成不同的发育分支之前通过吸引子状态，而 Nkx2-5 的扩展表达使 CPC 进入单向心肌细胞命运。此外，研究人员表明CPC 命运转变与明显依赖于 Isl1 和 Nkx2-5 的不同开放染色质状态相关。该数据提供了在单细胞分辨率下心脏祖细胞命运决定过程中的转录和表观遗传调控模型。
参考文献
Buenrostro JD, Wu B, Chang HY, Greenleaf WJ. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 2015 Jan 5;109:21.29.1-21.29.9.
Sun Y, Miao N, Sun T. Detect accessible chromatin using ATAC-sequencing, from principle to applications. Hereditas. 2019 Aug 15;156:29. doi: 10.1186/s41065-019-0105-9.
Lu Z, Hofmeister BT, Vollmers C, DuBois RM, Schmitz RJ. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res.2017 Apr 7;45(6):e41.
https://support.10xgenomics.com/Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1
Marand AP, Chen Z, Gallavotti A, Schmitz RJ. A cis-regulatory atlas in maize at single-cell resolution. Cell. 2021 May 27;184(11):3041-3055.e21.
Granja JM, Klemm S, McGinnis LM, Kathiria AS, Mezger A, Corces MR, Parks B, Gars E, Liedtke M, Zheng GXY, Chang HY, Majeti R, Greenleaf WJ. Single-cell multiomic analysis identifies regulatory programs in mixed-phenotype acute leukemia. Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1458-1465.
Jia G, Preussner J, Chen X, Guenther S, Yuan X, Yekelchyk M, Kuenne C, Looso M, Zhou Y, Teichmann S, Braun T. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nat Commun. 2018 Nov 19;9(1):4877.
原创声明：本文系作者授权腾讯云开发者社区发表，未经许可，不得转载。
如有侵权，请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除。
原创声明：本文系作者授权腾讯云开发者社区发表，未经许可，不得转载。
如有侵权，请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除。