Nature neuroscience：大鼠功能连接分析的共识方案
原创Nature neuroscience：大鼠功能连接分析的共识方案
原创
动物模型中的无任务功能连接提供了一个实验框架，以检查受控条件下的连接现象，并允许与在侵入性或终末操作下收集的数据模式进行比较。目前，动物的获取采用不同的方案和分析，这妨碍了结果的比较和整合。在这里，我们介绍了在20个中心测试的大鼠功能磁共振成像采集协议StandardRat。为了优化采集和处理参数，我们首先收集了来自46个中心的65个大鼠功能成像数据集。我们开发了一个可重复的流程来分析不同方案获得的大鼠数据，并确定了与跨中心功能连接稳健检测相关的实验和处理参数。我们表明，相对于之前的采集，标准化协议增强了生物学上合理的功能连接模式。本文描述的方案和处理流程与神经影像社区公开共享，以促进互操作性和合作，以应对神经科学中最重要的挑战。
理解大脑需要跨越空间和时间尺度的多层次方法。无任务状态下的功能磁共振成像(fMRI)揭示了不同的脑网络特征，这些特征在理解健康大脑功能和疾病机制方面发挥着核心作用。这种血流动力学读出方法依赖于血氧水平依赖性对比信号的自发波动来推断大脑的功能连接(FC)。通过专注于无任务fMRI数据的开放数据共享计划，人类神经影像学在理解大脑方面取得了巨大进展。尽管如此，动物模型(尤其是小型啮齿类动物)仍在神经科学发现中发挥着重要作用，部分原因是对基因控制的动物进行侵入性和终末操作的可行性。例如，大鼠通常被用于药理学研究，因为它们在药物代谢方面有相似性，也被用于行为神经科学，因为它们对复杂任务的学习非常熟练。通过利用在人类中获得的相同神经影像学方法和指标，啮齿类动物的无任务神经影像学可能提供了一种过渡，使其不需要仅在动物模型中可能使用的侵入性方法。
人类神经影像共享计划已经导致了fMRI采集协议的标准化，这有助于数据的传播、聚集和重用。相比之下，临床前神经影像学基本上仍然没有统一的指南。动物数据采集在不同的方案下进行，包括不同的应变、约束和麻醉条件、射频线圈设计和磁场强度。这些影响了结果和结论的泛化性。提出采集和/或预处理协议的努力很少超出单个实验室的范围，因此限制了互操作性和广泛采用。由于fMRI在啮齿类动物中具有纵向研究全脑连接现象的生物学基础的潜力，因此一个优化的共识协议可能会促进未来的科学发现。
在这项预先注册的研究中，我们收集并公开了大鼠不同fMRI采集协议的代表性数据集，并确定了与稳健和可靠的FC检测相关的实验参数。我们负责管理MultiRat_rest数据集(来自65个数据集的646只大鼠)，这些数据代表46家机构使用的方案。基于对MultiRat_rest数据集的分析，我们设计了一个新的共识方案，并使用它来汇总标准rat数据集(来自21个数据集的209只大鼠)。采用基于啮齿类动物的fMRI预处理和分析工具，针对不同特征的数据进行预处理和混杂校正。我们的主要结局是检测出与生物学预期模型相对应的似是而非的FC模式。通过整理来自50个中心和855只大鼠的数据，我们发现标准化的采集和相关的预处理流程优化了大鼠分布式fMRI网络的检测。与其他物种的大规模研究一致，我们已免费发布了所有数据和生成的代码。
1. 结果
我们汇总了MultiRat_rest收集的非标准化fMRI数据集(n = 65个数据集和n = 646只大鼠)。正如预期的那样，我们发现记录的所有实验因素有高度异质性，包括大鼠特征(性别和品系，图1a,b，年龄和体重)，扫描生理(麻醉/唤醒和呼吸频率;图1c、e)和图像采集(磁场强度、序列和序列参数;图1 d, f, g)。值得注意的是，有很大的性别偏向偏向于雄性(图1a)。同样，麻醉方案的分布也符合该领域的当前趋势(图1c)。尽管采集参数和随后的图像质量分布不均(图1g,h,i)， 646次扫描中有638次通过了预处理质量控制(1次扫描过度运动，1次空扫描和6次扫描图像配准失败;图1j,k)。作为进一步的质量控制，我们描述了时间信噪比和运动参数。总体而言，我们发现汇总的数据集代表了当前啮齿动物fMRI的采集趋势。此外，鉴于错误配准导致的低排除率，我们得出结论，尽管采集参数有很大差异，RABIES工具箱仍然可以有效地用于大鼠数据集的预处理。这为跨站点的可重现和可互操作的数据处理铺平了道路。
图1 MultiRat_rest数据集描述
我们主要研究感觉皮层的FC，因为感觉网络在fMRI通常使用的麻醉深度范围内评估麻醉效果是稳健的。更具体地说，我们使用两个互补的标准作为准确识别FC的指标来评估S1桶视野区域(S1bf)连接的特异性(图2a,b)。第一个标准是大脑半球间感觉皮层(barrel field, S1bf)之间的强连接。事实上，在人类和动物中，从FC最初的描述开始，包括感觉-运动网络在内的大多数网络都具有双侧同伦结构。第二个标准是S1bf与前扣带回区(ACA)弱相关或反相关。ACA是负任务啮齿类动物默认网络的主要节点。任务正性(作为s1bf相关感觉网络和任务负性网络通常不相关或反相关。根据上述两种标准将每只动物的FC分为特异性、非特异性、伪连接和无连接4类。对5个混杂校正模型进行了检验(补充表2和图2c)。全局信号回归(GSR)模型在特异性连接检测中表现最好(40.8%的动物有特异性连接，11.8%为非特异性连接，13.6%为假连接，33.9%为未检测到FC;图2 c, d、g)。为了检验该指标对其他网络的通用性，我们对啮齿类动物默认网络的节点扣带回皮质进行了相同的质量控制，结果显示扣带回皮质的连接特异性较低(22.1%;由于网络推断通常在组水平而不是个体水平进行评估，因此我们对每个数据集进行了单样本t检验，以估计相对于S1bf种子和其他三个种子，在组内检测到的对侧连接的发生率(图3)。65个数据集中多达70%的数据相对于种子，对侧连接的证据有限。50%的数据集在组水平上捕获了一个更大的感觉网络的特征。我们得出的结论是，与我们在小鼠中报告的情况相似，大鼠数据集未能同样捕捉FC 。我们还发现，GSR增强了S1bf种子特异性连接的发生率，因此我们决定在接下来的分析中使用这一混杂模型。
图2 FC特异性
图3 在组水平(n = 65个数据集，每个数据集n ~ 10个受试者)，4个种子的FC发生率
我们的观察结果强调了在实验性网络神经科学中，需要一种改进的采集协议来最大化个体水平的推断，以增强发现。为了解决这一问题，我们在MultiRat_rest集合中评估了与特异性发生率增加相关的参数。由于我们的分析依赖于分类数据，因此我们使用卡方检验检验了作为麻醉和序列类别函数，4个连接类别与预期频率分布之间的差异。美托咪定/异氟醚麻醉复合条件在特异性扫描中得到富集(图2e)。使用梯度回波成像序列也与较高的特异性发生率相关(图2f)。基于这些观察结果，我们设计了基于数据集ds01031的麻醉方案(9/10次特异性扫描)和基于数据集ds01028的成像序列(8/10次特异性扫描)，在4.7T的中场系统上采集。这种序列选择是合理的，因为它允许在这个集合中使用的一个低场系统上检测特定的连通性，而且对于更高场系统也应该有很好的性能。我们根据场强优化了相关序列参数(回波时间、反转角和带宽)(补充表1)。我们假设该方案将增强功能特异性，同时与仍在使用的系统中占相关份额的低场强系统兼容(图1d) 。使用这一共识方案，我们管理了来自20个中心的21个数据集的标准rat收集。这包括209只大鼠(93/116雌性/雄性)，主要是2月龄的Wistar大鼠(189/209)(扩展数据图6)。在4.7T到17.2T的磁场强度下进行数据采集。预处理的执行与非标准化数据集相似。209次扫描中共有207次通过了质量保证(2次由于图像配准错误而被丢弃)。有趣的是，尽管使用了相同的麻醉方案，fMRI采集开始时报告的呼吸频率随着大鼠品系的不同而不同(图4a,b)。最后，时间信噪比随磁场强度变化的影响可以忽略不计(图4c)。
标准rat研究的目的是提高对单个数据集特异性连接的检测。我们发现，使用GSR时，61.8%的扫描被归类为具有特异性连接(图4d)，而在具有非标准化获取的MultiRat_rest数据集中，40.8%的扫描被归类为具有特异性连接。当我们比较来自两个中心的数据集时，差异仍然存在。这与之前的观点相悖，之前的观点认为，标准rat采集的优势是由于贡献实验室的特点(例如，磁体类型或强度以及在数据采集方面的更丰富经验)。有趣的是，我们无法确定场强对连接特异性的影响，这表明采集系统不是该方案的限制因素。我们的结论是，在检测生物学上合理的连接模式方面，新标准化的协议平均优于社区中以前使用的协议。最后，为了探索全脑连接模式，我们在数据集水平检查了4个选择的种子和组独立成分分析(图4e)的连接发生率。我们发现，与MultiRat_rest数据集相比，数据集水平的远端连接检测有所改善，并发现了先前描述的横跨全脑的啮齿动物网络的证据。
图4 数据集描述
有趣的是，标准rat收集的数据集之间的连接模式仍然存在差异。事实上，21个数据集中有5个达到了90%或更高的特异性。这强调了我们研究方案的潜力，但也需要了解哪些因素阻碍了其他数据集。接下来，我们试图确定与特定连接模式发生率较高相关的变量。值得注意的是，我们无法建立应变、性别或磁场强度的影响，这表明该方案适用于大范围的条件(补充表3)。接下来，我们检查了呼吸频率和时间信噪比作为采集变异性的指标。呼吸频率从84到114次/分(bpm)和皮质颞叶信噪比大于53的扫描在标准rat收集中获得了更高的连接特异性发生率。这些提供了通过确定可进一步提高连接结果的实践来完善标准rat协议的第一线证据。这些观察结果的重要性需要在新的数据集(最好是跨多个中心)中进行确认，然后才能用新的指南更新StandardRat方案。
2. 讨论
总之，我们管理了两个数据集(MultiRat_rest和StandardRat)，分析了它们并使它们成为开放访问的资源。据我们所知，这些是目前可用的最大的啮齿类动物fMRI数据集。我们开发并部署了可推广到大多数扫描和每个数据集的预处理和混杂校正策略。利用来自MultiRat_rest收集的信息，我们提供了有用的人群参数估计值，以增强大鼠fMRI数据集的比较。我们提出并评估了一个新的标准化协议，发现这个共识采集和预处理流程在连接特异性方面优于之前的收购。为了允许复制并激发新的分析，我们将所有原始和处理过的数据发布给更广泛的社区。平均而言，标准化协议比之前在MultiRat_rest集合中收集到的数据有了改进。然而，个体水平的推断仍然局限于61.8%的扫描结果。为了进行比较，我们使用相同的质量保证指标，在7T人类连接组项目(Human Connectome Project)数据集中(基于184次扫描)，估计特异度为55%。这强调了在生物学上合理的FC假设基础上实施健全的质量保证指标的重要性。通过了解导致成功采集的因素、增强方案、预处理或妨害回归模型，提高产出质量，将产生切实的结果，能够进一步增强未来的数据采集，并通过减少丢弃来减少动物使用。值得注意的是，我们的新方案依赖于浅镇静来约束动物。虽然该方案针对fMRI进行了优化，但可能无法推广到电生理等其他操作。我们还发现，现有的清醒限制协议，平均而言，导致特定连接模式的发生率较低。之前的一份报告在清醒大鼠的数据集中显示了类似的数值，我们使用RABIES流水线进行了预处理，证实了这一点。由于麻醉对网络的影响，开发清醒成像作为替代方案仍然至关重要。然而，应该通过质量控制指标来检查这些协议，以确保一致地实现合理的连接模式。此外，生理因素，如心率，几乎没有报道。这限制了我们研究这些因素对连接结果可能产生的影响的能力。我们借此机会鼓励社区获得这些数据，并在随后的出版物中报告它们。最后，标准rat中的采集序列被设计成可以在许多系统上运行。新序列的有效性应对照目前的方案进行检查，例如各向同性分辨率或多波段采集。我们项目在方法和概念上的进步是大规模多中心大鼠神经影像采集的第一步。神经影像学和其他学科的协调开放科学项目正在改变科学格局24。通过我们各中心的共同努力，并通过大幅改进的方案得到加强，大鼠功能性脑成像有望解决神经科学和精神健康研究中的紧迫问题。
3. 方法
3.1 预注册
本研究为预注册研究(https://doi.org/10.17605/OSF.IO/ EMQ4B)。以下是值得注意的偏差。我们使用SIGMA大鼠模板，而不是Papp等人的模板，原因是伪影较少、有额外的相关条件和改进的体内对比度。一些数据集有视野裁剪，以简化图像配准。一些数据集进行了时间序列裁剪，以减轻计算负荷。我们使用的是时间信噪比，而不是信噪比，因为这两者被证明是相关的。详细的偏差列在这里:https://github.com/grandjeanlab/MultiRat。
3.2 动物
所有收购均在获得当地和国家伦理当局批准后进行。要求参与实验室提供n = 10次大鼠影像采集，包括一次解剖和一次静息态功能运行。排除标准为不适合RABIES预处理(例如需要专门的图像重建和视野受限)。MultiRat_rest收集了来自46个研究中心和646只大鼠(141/505雌性/雄性)的65个数据集。标准rat由来自20个研究中心的21个数据集和209只大鼠(93/116雌性/雄性)组成。作为比较，从单中心清醒大鼠数据集中纳入224次扫描(n = 39只大鼠)21。排除标准如下：图像错配(扩展数据图2)、过度移动以及数据缺失或损坏。
3.3 标准化MRI采集范式
根据MultiRat_rest分析结果确定标准化方案，并用于获取标准rat数据集。实验对象为大约2月龄的自由呼吸Wistar大鼠，雌雄不限，使用0.4%异氟醚和0.05mg每千克美托咪定皮下注射进行麻醉诱导，使用0.4%异氟醚和0.1 mg/kg/h美托咪定皮下注射进行麻醉维持。麻醉诱导后40 min采用梯度回波平面回波成像技术进行成像，重复时间= 1000 ms，回波时间/反转角/带宽与场强的函数关系，重复次数= 1000次，矩阵大小[64 × 64]，视野25.6 × 25.6 mm?, 18个间隔0.1 mm的交错轴向层。完整的协议可以在这里获取:https://github.com/grandjeanlab/StandardRat
3.4 数据预处理和混杂校正
扫描根据bid格式进行组织。使用RABIES毒可重复容器软件环境(Singularity 3.7.3-1)对每一次扫描分别进行预处理。采用autobox、N4非均匀校正、运动校正、功能扫描与解剖扫描之间的刚性配准、解剖扫描与模板之间的非线性配准以及公共空间重采样至0.3 × 0.3 × 0.3 mm?进行预处理。我们开发了一种体积图像配准和脑掩蔽工作流程，以解决啮齿类动物图像中发现的脑大小差异、图像对比度和磁敏感失真。对所有扫描的预处理输出进行目视检查以进行质量控制。使用基于ICA-AROMA、白质和脑室信号或GSR的三种方法对5个混杂校正模型进行了测试(补充表2)。这些方法与运动回归、空间平滑至0.5 mm?、0.01 Hz的高通滤波器和0.1 Hz或0.2 Hz的低通滤波器一起完成。通过使用专门的大鼠脑脊液和脑边缘面罩，并基于一组啮齿动物图像训练分类器参数，将ICA-AROMA方法从人类应用到大鼠。对成分及其分类的目视检查表明，不到5%的似是而非的信号成分被错误地标记为噪声。
3.5 数据分析
为了确定大鼠的FC，我们在模板空间中使用RABIES，在S1bf、ACA、尾状核和初级运动区放置直径为0.9 mm的球形种子。采用Pearson相关系数计算区域间的功能连接。使用对侧右侧S1bf感兴趣区域作为特异性感兴趣区域，ACA作为非特异性感兴趣区域，定义相对于左侧S1bf种子的功能连接特异性。对每只动物进行FC评估，并将其分为4类:特异性;非特异性;no;和伪连接(剩余情况)。为了评估默认网络的连接特异性，同样的方法在ACA中加入了种子。特异性感兴趣区位于ACA，非特异性感兴趣区位于S1bf。为了评估全脑连接，使用Nilearn (https://github.com/grandjeanlab/MultiRat/ blob/master/assets/nifti/canica_resting_state_clean.nii.gz)对n = 20个成分进行组独立成分分析。我们根据Zerbi等中定义的标准评估了成分的生物学合理性。为了与人类进行比较，我们对7T人类连接组项目(Human Connectome Project)数据实施了相同的质量控制指标。使用3dTproject进行带通校正(0.01-0.1 Hz)和平滑(2.5 mm?)。感兴趣区位于感觉皮层和ACA。
3.6 统计分析
样本量是根据形成这个集合的可用数据集确定的。本试验未进行随机分组。数据收集和分析不受实验条件的限制。使用Nilearn 0.7.1进行单样本t检验体素图和组独立成分分析。FC特异性和分类变量(如磁场强度、应变和性别)之间的比较采用卡方检验。连续变量(如平均帧间位移(MFW))被转换为6个分类，以允许与卡方检验进行比较。使用pingouin0.5进行线性回归和方差分析。单个基于种子的地图被表示为r>0.1的彩色编码覆盖阈值。考虑到对FC检测的重视以及影响FC检测的因素，我们通过对单样本t检验图应用Puncorrected< 0.05的宽松阈值来减少假阴性，遵循预先注册的规范。这种阈值设定是合理的，因为我们不希望排除任何具有微弱FC潜在痕迹的数据集。相对于前连合的切片位置以毫米表示。
参考文献：A consensus protocol for functional connectivity analysis in the rat brain.
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