读《结节状病灶细胞生态学的单细胞视角》
跟着运来兄搭建自己的生物信息小书房。趁年轻，读几本硬书，到老了慢慢反刍。
与其说是一本书，不如说是博士生论文，它的名字叫做Understanding the Cellular Ecology of Mtb Granulomas Using Single-Cell Sequencing。与这份毕业论文的缘分，要从一个习惯讲起：隔三岔五地会用Understanding和Single-Cell Sequencing作为关键词在学术期刊中查询一些文章，以期看看单细胞测序还有哪些新的方向和视角。
引用本文提到的论文：
Hughes, Travis K. 2020. Understanding the Cellular Ecology of Mtb Granulomas Using SingleCell Sequencing. Doctoral dissertation, Harvard University, Graduate School of Arts & Sciences.
这篇文章为我们提供了一个生动的结合课题需要开发自己单细胞体统所需要考虑的细节，加上最近又比较关心感染和宿主单细胞-微生物互作这个领域，就把这篇文章翻了翻。开卷有益，在这一期的生信书房中为大家分享一下~
非常标准的技术与科学问题结合案例 ：提出问题->开发方法->方法验证->应用方法->数据分析。
- 内容提要：
- 结合课题需要定制/设计/优化单细胞系统
- 生物安全级别高的实验室单细胞平台的选择(Biosafety Level 3)
- 结核分枝杆菌感染类样本为什么微孔法优于液滴法
- 对于新开发的单细胞系统，有哪些验证方法/维度
- 肉芽肿单细胞数据分析特点
众所周不知，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染可以导致肺肉芽肿的形成，肺肉芽肿是由间质、实质和免疫细胞组成的复杂结构。虽然个体内的结核分枝杆菌肉芽肿在控制细菌感染方面的能力不同，但我们缺乏对宿主-微生物互作下免疫学基础的完整了解。在这里，作者开发了Seq-Well单细胞技术，并应用该方法来探索结核分枝杆菌肉芽息 肉的细胞组成与其控制细菌复制的能力之间的关系。
Cellular Composition of Mtb Granulomas
看完结核分枝杆菌，再来看看肉芽肿（granuloma）是由巨噬细胞及其演化的细胞局限性浸润和增生所形成的境界清楚的结节状病灶。
在文本中，基于前人开发的单细胞技术，作者进一步提高了由Seq-Well生成scRNA-Seq数据的信息量。利用这种改进的单细胞技术，构建了一个多种炎症性皮肤状况的细胞图谱，包括痤疮、脱发、环形肉芽肿、麻风病和牛皮癣。
在这里，我们不禁要问：为啥选用基于微孔法开发而非液滴法呢？作者在文中，给出了解释：
- 首先，在基于液滴的单细胞技术中，细胞进入微流控体系是串联的(一个接一个)而不是平行的，导致进入分离体系的第一个细胞和最后一个细胞之间的表型或转录变化。
- 此外，在许多液滴微流控方法中，样品必须使用单独的微流控通道进行顺序处理，这可能导致长时间的实验和随着时间的推移样品活力的损失。在涉及肉芽肿的实验中，时间是一个特别重要的变量，因为细胞活力和组织坏死在基线时就已经存在了。
- 其次，在液滴微流控系统中使用十分温和的裂解条件，以保持反乳化液油滴的完整性。而适用于结核分枝杆菌的硬裂解缓冲液（如5M硫氰酸胍）与反向乳液滴的物理完整性不相容。
作者开发的Seq-Well Pipeline如下：
与需要大量设备的液滴微流控系统不同，微孔法的磁珠和细胞的加载是通过重力实现的，只需要使用移液管和标准实验室设备即可进行高大上的单细胞实验。重要的是，Seq-Well可以兼容特殊的裂解条件，这是能够裂解结核分枝杆菌感染细胞的。
当然，作者的主要目的还是解决生物学问题。使用Seq-Well了解Mtb肉芽肿的细胞和分子特征与细菌控制之间的关系，并对来自食蟹猕猴的非人灵长类肉芽肿进行了scRNA-Seq检测。在低负荷病变中，作者观察到T细胞的整体扩张，特别是一组T1-T17 T细胞，而在高负荷病变中，有肥大细胞和浆细胞的扩张。揭示了细胞组成、肉芽肿形成的时间和细菌控制之间的微妙关系。
文章详情可以下载文献阅读，奉上论文目录~
Chapter 1: Introduction
Overview of Single-Cell mRNA Sequencing
Methods for Single-cell Sequencing
Seq-Well: Designing Single-cell technologies to study Mtb infection
Principles of Granulomatous inflammation
Chapter 2: Seq-Well: A Portable, Low-cost Platform for Single-Cell RNA-Seq of Low-Input Samples
Chapter 3: Highly Efficient, Massively-Parallel Single-Cell RNA-Seq Reveals Cellular States and Molecular Features of Human Skin Pathology
Chapter 4: Cellular correlates of M. tuberculosis control in pulmonary granulomas revealed through single-cell mRNA sequencing
Chapter 5: Conclusions and Future Directions