Salmon — 兼具高效、精准及偏差感知的RNA-seq定量工具
Salmon — 兼具高效、精准及偏差感知的RNA-seq定量工具
工欲善其事必先利其器
前面介绍了alevin 的单细胞定量功能，见 Alevin — 更快的单细胞定量，其也只是Salmon软件的一个组成部分，今天我们就再来学习一下 Salmon 其最初的功能 —— 转录组定量
1Salmon
Salmon 是由Rob Patro领导的团队开发的一款高效的生物信息学工具，主要用于定量转录组数据中的转录本表达量。其特性如下：
- 速度与效率：Salmon 使用了一种被称为“准映射”（quasi-mapping）的技术，该技术可以快速准确地将读段（reads）直接映射到转录本上，大大加快了处理速度并降低了内存需求。
- 无偏估计：软件在估计转录本丰度时，可以有效地避免系统偏误，使用复杂的统计模型来校正样本制备和测序过程中的偏差。
- 灵活的输入格式支持：Salmon 支持多种类型的输入数据，包括但不限于FASTA和FASTQ格式，能够处理单端和配对端数据。
官网：https://combine-lab.github.io/salmon/
GitHub：https://github.com/COMBINE-lab/salmon?tab=readme-ov-file
编程语言：C++
Salmon
2发表文章
文章信息：Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression 期刊：Nature Methods 日期：2017年3月 作者 & 单位：Rob Patro & Stony Brook University DOI：https://doi.org/10.1038/nmeth.4197
3如何安装
Salmon 提供了多种安装方式。包括但不限于 二进制版本、源码构建、Docker镜像、Conda安装等。由于源码构建所需依赖过多，所以推荐使用二进制版本、Conda、Docker镜像安装
Conda安装（推荐）
由于Github 没有提供最新版的salmon的二进制版本，所以推荐使用Conda安装
conda create -n salmon
conda activate salmon
conda install salmon -y
4定量基本流程
- 索引构建：首先，需要为参考转录组构建索引。这个过程包括对所有转录本的序列进行预处理，从而为快速准映射（quasi-mapping）做好准备。
- 准映射：在索引构建完成后，Salmon 使用准映射技术将读段（reads）直接映射到转录本上。这种方法不需要完全的比对，而是快速地估计读段与转录本的相似度，显著提升了处理速度。
- 表达量估计：映射完成后，Salmon 会根据映射的读段计算每个转录本的表达量。这一步考虑了读段覆盖度、转录本长度和测序深度等因素。
- 偏差校正：在定量的过程中，Salmon 还会进行偏差校正，尝试消除由测序和样本制备中引入的技术偏差影响。
- 输出结果：最后，Salmon 输出转录本的表达量估计，通常是以TPM（每百万转录本碱基数）单位表示。
5最小化使用
salmon有两种定量模式
基于映射模式的定量
准备文件
GENCODE：https://www.gencodegenes.org/
##下载对应物种的转录本fa文件
wget -c https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_45/gencode.v45.transcripts.fa.gz
## 创建salmon索引
salmon index -i homo_gencode_transcript_index -k 31 --gencode -p 8 -t gencode.v45.transcripts.fa.gz
-i #指定索引的输出位置和名称
-k #设置用于构建准索引的k-mer的长度，默认为31
-p #设置调用线程，默认为2
-t #输入文件；转录本的fasta格式文件
--gencode #此选项表明输入的fasta文件是GENCODE格式的，会在第一个`|`字符处切分转录本名称
索引文件
当然，部分物种也可下载官方构建好的索引文件，见：http://refgenomes.databio.org/
定量
## 双端测序
## salmon quant -i transcripts_index -l <LIBTYPE> -1 reads1.fq -2 reads2.fq --validateMappings -o transcripts_quant
salmon quant -i ~/ref/homo/homo_gencode_transcript_index -l IU -p 8 -1 SRR8707539_1.fastq.gz -2 SRR8707539_2.fastq.gz -o ~/GSE128101/salmon_paired_out/
-i #指定索引文件位置
-l #指定库类型的格式字符串。这个参数告诉Salmon你的测序库是单端还是双端，以及测序的方向性 (注意参数顺序，-l 参数要放在reads文件之前),不清楚的话可以设为 “A”
-1 # reads 文件1
-2 # reads 文件2
-o #输出结果目录
-p #设置调用线程（默认256），建议8~12个线程
--validateMappings #早期版本的 Salmon 中，需要显式启用选择性对准来优化映射质量。在较新版本的Salmon中已被标记为弃用，并且没有效果。因为选择性对准（selective alignment）现在是Salmon的默认行为
## 单端测序
## salmon quant -i transcripts_index -l <LIBTYPE> -r reads.fq --validateMappings -o transcripts_quant
salmon quant -i ~/ref/mouse/mouse_gencode_transcript_index -l A -p 8 -r SRR8734841.fastq.gz -o ~/GSE128101/salmon_single_out/SRR8734841
-r # 指定单端样本
-l A #自动检测读段方向
双端演示
单端演示
关于 -l 参数 库类型
对于单端测序
- A: 自动检测读段的方向
- U: 未指定方向性（未知或不相关）
对于双末端测序
- A：自动检测
- IU: 内向配对（inward），未指定方向性
- ISF: 内向配对，正向/正向
- ISR: 内向配对，反向/反向
- OSF: 外向配对，正向/正向
- OSR: 外向配对，反向/反向
- MSF: 匹配配对，正向/正向
- MSR: 匹配配对，反向/反向
I 代表内向（inward）配对，O 代表外向（outward）配对，M 代表匹配（matching）配对。S 代表正向（same），R 代表反向（reverse）
示意图
基于比对模式的定量
Salmon期望提供的对齐文件是针对与FASTA文件中给出的转录本进行的。这意味着读段应该直接对齐到转录本上，而不是整个基因组。这与一些其他工具（如Cufflinks）不同，后者是对整个基因组进行读段的对齐
## 比对
## hisat2 -p 4 -x ~/ref/homo/hisat2_trans_index/homo_gencode_v45 -1 SRR8707540_1_val_1.fq.gz -2 SRR8707540_2_val_2.fq.gz |samtools sort -@ 4 -o ~/GSE128101/hisat_trans_out/SRR8707540_sort.bam
## salmon基于比对模式的定量
## ./bin/salmon quant -t transcripts.fa -l <LIBTYPE> -a aln.bam -o salmon_quant
salmon quant -t ~/ref/homo/gencode.v45.transcripts.fa -l IU -p 8 -a ./SRR8707540_sort.bam -o ~/GSE128101/salmon_paired_out/SRR8707540_bam
基于比对模式
6结果文件
结果文件
主要结果
以制表符分割的定量文件 —— quant.sf
quant.sf
- Name（名称）：输入转录本数据库（FASTA文件）中提供的目标转录本的名称
- Length（长度）：目标转录本的长度，以核苷酸计算
- EffectiveLength（有效长度）：这是计算得出的目标转录本的有效长度。它考虑了所有影响从该转录本采样片段的概率的因素，包括片段长度分布、序列特异性和GC片段偏差（如果这些因素被建模）
- TPM（每百万转录本数）：Salmon估计的该转录本的相对丰度，单位为每百万转录本数（TPM）。TPM是推荐用于下游分析的相对丰度测量单位
- NumReads（读段数）：Salmon估计的映射到每个被定量转录本的读段数量。这是一个“估计值”
更多参数信息详见：https://salmon.readthedocs.io/en/latest/salmon.html
参考：
- https://salmon.readthedocs.io/en/latest/salmon.html