可体外杀死肿瘤细胞！北航团队《Small》发布铁磁流体机器人，用于窗口肿瘤光热治疗
可体外杀死肿瘤细胞！北航团队《Small》发布铁磁流体机器人，用于窗口肿瘤光热治疗
得益于优异变形能力、可控性和驱动方式灵活性，可以在外部施加的磁场影响下实现精确形状改变的微型磁性软体机器人近年来已被开发用于诊断和治疗各种疾病。
其中，铁磁流体机器人（FR）凭借非磁性材料的流体特性，展现出卓越的变形能力，这使其在医用领域的应用范围更为广泛。此外，在液体环境中，FR展现出优秀的自组装特性，并且保持了不混溶性。在微米级的机器人群体中，FR还具备主动或被动分散的潜力，这为其赋予了群体控制的机器人属性。这一特性使FR在适应如血管分支等复杂体内环境时更具通用性，尤其适用于靶向治疗应用。
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但由于铁磁流体机器人应用于人体上仍有许多关键问题有待解决，因此关于铁磁流体机器人的大多数研究都是在体外进行。如何将铁磁流体用于体内医学应用仍然是一个巨大的挑战。
前不久，北京航空航天大学机械工程及自动化学院“卓越百人”副教授、博士生导师冯林课题组在纳米科学领域权威期刊《Small》以Research Article形式发表了最新的研究成果《生物相容性基于铁磁流体的 Millirobot 用于近红外 II 窗口肿瘤光热治疗》（Biocompatible Ferrofluid-Based Millirobot for Tumor Photothermal Therapy in Near-Infrared-II Window）该研究提出了一种通过具有生物相容性的磁流体机器人（BFR）实现肿瘤的光热治疗方法。该方法将磁流体的基载液改为具有生物相容性的植物油，通过三维电磁控制系统实现磁流体机器人的靶向控制。
图2
在这项研究中，冯林课题组介绍了一种具有生物相容性的磁流体机器人（BFR）的制备方式，构建了一个可以在复杂的生物介质中实现 3D 磁驱动控制系统进而实现了磁流体机器人在复杂的生物介质中进行3D磁驱动，并对磁流体机器人实现血液环境运动控制和肿瘤杀伤的潜力进行了验证，证明了生物相容性磁流体机器人在癌症治疗方面具有应用前景。该论文第一作者为机械工程及自动化学院硕士生纪易明，通讯作者为冯林教授。
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▍生物相容性与可控性兼具，BFR如何制备？
要想在体内应用FR实现疾病诊断和治疗，必须确保其具备良好的生物相容性和可控性。
由于其独特的磁场产生装置，磁流体机器人天然具备可变形、可重构、自愈和导电等特点，并展现出高度的环境适应性。此前，关于如何控制FR变形以适应复杂多变的执行环境的研究已有诸多研究并取得不错进展。但关于如何保证FR生物相容性的问题研究进展却不算理想，这对其在体内的应用构成了严重限制。
在磁流体机器人的相关研究中，硅油或矿物油铁磁流体经常作为FR的基液加以使用，而这也正是FR生物毒性的主要来源，使用生物相容性碱溶液是解决这一问题的有效途径。也因此，研究组选择采用Fe3O4纳米颗粒、油酸和植物油组成BFR，并使用共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒。
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在纳米颗粒制备过程中，研究组使用油酸将磁性颗粒表面包覆，将包覆油酸的磁性颗粒洗涤、干燥得到具有磁性颗粒的粉末，并通过石蜡溶解进行初步筛选。图 5A显示了XRD数据，其中尖峰对应于Fe3O4(JCPDS 3–0863) 的微晶。所制备的颗粒（图 5B）和最终产品（图 5C）的FTIR数据的比较表明油酸成功地包覆在Fe3O4颗粒上。通过与裸Fe3O4纳米粒子的FTIR光谱进行对比，得以知晓Fe3O4纳米颗粒在共沉淀合成过程中被羟基覆盖。通过与在油酸包覆的Fe3O4纳米颗粒的FTIR光谱进行对比，得出Fe3O4纳米颗粒由过量油酸合成并被双层油酸包覆的，纳米颗粒的直径约为10 nm。
图5 A) Fe3O4纳米颗粒的XRD；B) Fe3O4纳米粒子的FTIR；C) OA 包覆的 Fe3O4纳米颗粒的 FTIR；
通过将过量的粉末和油混合，搅拌，在超声波清洗器中振荡30分钟，研究组获得磁性纳米粒子和植物油的混合物形成上清液即实验所需的植物油基铁磁流体，该植物油基铁磁流体具有稳定的Fe3O4纳米粒子分散体，并表现出流体特性和磁控制的结合。
通过检验，BFR中纳米粒子百分比可达7.8 wt%，这保证了其可变形性和可控性（图 6E，F）。此外，BFR在不同的磁场强度和温度下的粘度变化也变化较小，这表明铁磁流体可在不同温度和磁场强度下保持相似的变形能力。
图6 D) BFR 中纳米颗粒的透射电子显微镜 (TEM) 结果；E) 所制备的铁磁流体的磁滞线；F) 铁磁流体的紫外-可见-近红外吸收光谱；G) 不同浓度的BFR在1064 nm NIR照射下的温度曲线；H) BFR 在五次加热-冷却过程中的光热稳定性研究
同时，Fe3O4纳米粒子的存在也使BFR表现出光热性能。研究组利用400-1600 nm光吸收实验获得了BFR的红外吸收光谱。光谱显示BFR在1064 nm红外波长处表现出高吸收率，这与在光热治疗过程中可以有效杀伤体内深部肿瘤细胞的1064 nm激光波长保持了一致性。
图7 BFDRs的光热效应模拟。NIR激光照射5分钟后的热辐射图（7.8%BFR）。(B)24孔板各井的地面温度分布曲线。
通过将将0.5 ?L具有不同磁性颗粒浓度的铁磁流体液滴添加到24孔板中，并用1064 nm光源照射5分钟，研究组得到BFR升温和冷却循环曲线曲线（图6H）。结果显示，纳米粒子的浓度与温度的升高之间呈正相关， BFR具有良好的光热稳定性。
由此，研究组获得了兼具生物相容性和可控性的BFR。
▍四电磁线圈系统产生均匀梯度磁场，实现对BFR运动精准控制
图8 四线圈系统的结构。它由六个部分组成：计算机、数据卡、驱动器、电源、线圈和摄像头。
控制系统的准确性对于BFR通过血液循环系统提供靶向治疗的能力至关重要。
BFR机器人可以利用梯度磁场在液体环境中实现精确的运动控制，也因此研究组设计了可以产生均匀梯度磁场的四电磁线圈系统来实现对BFR的精准运动控制。通过向系统线圈施加不同值的直流电，亦可对BFR的移动速度进行控制。
在体外实验中，具有视觉反馈的控制系统可以控制BFR向任意方向移动。研究组通过自动控制BFR沿三角形路径行走，并计算和计数控制误差对系统的控制误差进行了分析。结果显示，BFR在不同方向上的控制误差总体一致，自动控制的误差主要集中在0.1mm左右。
视频演示：https://mpvideo.qpic.cn/0bc3j4aaqaaa44abqcvkdvsvat6dbbhqacaa.f10004.mp4?
图9 BFR Control along “A” Trajectory
由于BFR不与血液混合，因此研究组亦控制其在充满血液的微流体迷宫中移动，对其变形能力、可控性和驱动灵活性进行了测试。
图10 BFR Passes Through Narrow Channel by Deformation
图11 BFR Passes Through Bifurcation Channel by Splitting
通过控制BFR自突然变窄的模拟血管中进行移动，研究组证明了BFR通过变形和分裂穿过狭窄通道的能力。
图12 BFR Controlin 3D Vascular Model
为了进一步验证BFR在脉管系统中移动的能力，研究组利用简单三叉神经血管和复杂肝门静脉血管的3D模型进一步对BFR变形运动的可控性进行了验证。结果表明，BFR 可以通过更薄、更复杂的分支血管网络，变成更小的 BFR，然后重新组合，向目标移动。
图13 BFR Upstream movement
同时，BFR也可以在充满血液的血管模型中向上游游动，这是体内使用的微纳机器人必须实现的功能。这些功能在靶向治疗领域具有巨大的应用潜力。
图14 BFR Controlin 3D Hepatic Portal Vein Model
为了测试BFR在复杂血管环境中的移动能力，验证BFR在真实动物的不平坦组织表面和平坦血管表面上的运动可控性，研究组构建了模拟肝门静脉的3D模型，并将BFR注射到血管模型的右上角，在梯度磁场的控制下，BFR 通过分叉和细管发生分裂和变形。这些部分最终汇聚在血管模型的左下角。
图15 BFR Control on a Heart Tissue
充满凹槽的表面，例如心脏的内表面，也存在于血液循环干中。因此，在另一项体外实验中，研究组将心脏组织块固定在玻璃皿的底部并充满盐水溶液，并将BFR添加到水中、沉积在心脏组织表面。在磁场控制下，BFR 沿着心脏内表面凹槽平滑移动。
图16 Ultrasound Localization of BFR in Vessel
成像观察对于控制血管系统运动非常重要，研究组对此亦进行了验证。通过使用25 MHz超声波对牛心脏血管及其内部环境进行成像，超声波成像清晰地显示了运动控制过程中BFR 的位置。这表明了研究组制备BFR具有良好的超声成像，可将其定位在脉管系统中。同时也意味着视觉跟踪BFR在体内的运动成为可能，进一步证明了BFR通过光热转换效应在靶向肿瘤治疗中应用的可能。
▍杀死肿瘤细胞？BFR光热效应“杀伤”效果如何？
对于BFR 的光热效应是否可以用于以受控方式杀死癌细胞，研究组也通过实验验证了不同浓度BFR在不同功率NIR光功率下的杀伤效果。
通过CCK-8细胞活力实验，研究组得出硅油铁磁流体(EMG901)和矿物油铁磁流体显着抑制细胞活力，而浓度高达 7.8 wt%的 BFR 不会抑制细胞活性的结论，初步验证机器人的生物相容性，并进一步证实了BFR的生物安全性。
图17 A) 所制备的铁磁流体 (BF) 与研究中常用的其他铁磁流体相比的生物相容性。B) BFR光热效应杀伤肿瘤细胞示意图。C) 肿瘤细胞的活/死染色 (4T1)。比例尺：200 ?m。D) 不同处理后的细胞活力。E) 目标区域和非目标区域的概念图。F) 近红外激光照射 5e 分钟后细胞培养物的热辐射图。G) 井地温分布曲线。H) 靶向细胞杀伤的细胞染色图。比例尺：500 ?m。I) (H) 中橙色箭头方向的荧光强度统计。J) 目标区域和非目标区域之间的细胞活力比较。
通过磁力操纵测试，当受到1064 nm近红外光刺激时，BFR可以附着在细胞表面并产生热量来杀死周围的肿瘤细胞（图 17B）。实验结果表明，在2.5 W cm -2辐照功率下，7.8 wt% BFR的热杀灭效果达到80%；3.9wt％BFR的杀灭效果达到58％(图17 D )。细胞死亡染色显示出类似的细胞毒性作用。在2.5 W cm -2功率刺激下，7.8和3.9 wt% BFR可以杀死辐射范围内的所有细胞（图17 C）。
此外，研究组根据BFR的光热曲线确定了肿瘤杀伤的靶向可控性（图 17E）。根据模拟结果，BFR的温度从中心向周边逐渐降低（图17 F，G）。这种光热分布可能导致肿瘤细胞死亡的相同趋势；也就是说，肿瘤细胞死亡从BFR中心区域到周围区域呈梯度下降（图17 H，I）。无BFR覆盖区域的肿瘤细胞死亡率显着低于BFR覆盖区域（图 17J）。这些数据证明，通过控制BFR的位置可以控制光热分布，从而实现对肿瘤细胞的可控杀伤。
通过进一步活体实验，以上实验结论在4T1荷瘤小鼠中得到进一步验证。
在基于BFR光热效应对4T1荷瘤小鼠体内肿瘤进行治疗的过程中，研究组对小鼠的肿瘤体积进行了记录。
与对照组相比，所有接受近红外治疗的小鼠均出现不同程度的烧伤斑。FDDR+MAG NIR治疗组的肿瘤比其他组受到更明显的抑制（图18 A），并且分别治疗后的第3天和第6天肿瘤体积比对照组小56.73%和67.48%（图18 C）
图18 体内肿瘤杀伤实验。A) 治疗六天后各实验组裸鼠的肿瘤状况；B) 体重曲线；C) 肿瘤大小曲线；D)治疗6天后分离的肿瘤组织的体积统计；E)从小鼠收集的肿瘤切片的H&E染色结果。比例尺：50 ? m；F,G) 肿瘤切片的TUNEL和KI67染色结果。黑色背景图像是荧光图像，白色背景图像是特征荧光图像。比例尺：100 ? m。
治疗6天后，虽然各组小鼠的体重没有显着差异（图 18B）。但对小鼠实施安乐死，并切除肿瘤组织后进行对比发现，离体肿瘤组织比所有其他组的肿瘤组织小并且显示出明显的坏死迹象，NIR+BFR+MAG组的离体肿瘤组织体积明显小于其他组，与对照组相比减少了70%（图18 D）。
肿瘤组织切片苏木精和伊红染色显示，与其他组相比，NIR+BFR+MAG组肿瘤细胞稀疏并伴有坏死。肿瘤组织切片的PB染色显示，磁场下肿瘤组织中积累了更多的BFR（图18 E）。TUNEL染色结果显示，NIR+BFR+MAG组细胞凋亡率显着高于其他组（图18 E）。相比之下，NIR+BFR+MAG组的肿瘤细胞增殖指数显着低于所有其他组（图18 F）。
基于这些数据，有理由相信本研究开发的BFR可以在磁场控制下靶向肿瘤组织，产生热量杀死肿瘤细胞，并在近红外光照射下抑制肿瘤细胞的增殖。
该研究成果不仅为复杂血液循环中实现药物递送和肿瘤治疗提供了新的突破点，也为基于铁磁流体微型机器人进行体内靶向治疗提供参考。
▍结语
值得注意的是，此前，冯林教授带领的课题组还曾提出一种名为“特洛伊木马”的药物递送策略，开发了一款新型微纳米机器人“巨噬细胞机器人”。通过利用巨噬细胞作为载体装载肿瘤杀伤药物，该巨噬细胞机器人可避免体内免疫排斥，将药物精准运送到特定组织或器官，从而在近红外光的作用之下，让药物进行可控的释放，进而对肿瘤进行精准消杀。
相关论文亦以《精确控制定制巨噬细胞细胞机器人，用于实体肿瘤的靶向治疗，具有最小的侵入性》为题在《Small》上进行了发表。
图19
由高分子聚合物、脂质体或纳米颗粒等生物相容性材料制成的微纳米机器人，可以搭载药物通过物理或化学手段将药物直接送达肿瘤部位，从而提高治疗效果并减少副作用，在实现肿瘤的精准靶向和药物传递方面具有巨大的潜力。
尽管这种技术由于涉及纳米级尺寸的操控，安全性、稳定性和生产成本等方面的问题仍有待进一步解决，其在肿瘤治疗中的应用也仍处于起步阶段。
但随着越来越多团队和企业的研究与开发，或许未来不久，我们便能通过将微纳米技术与肿瘤治疗相结合，实现真正意义上的精准医疗。
参考文章：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202302395
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