单细胞+空间蛋白组鉴定三阴乳腺癌不同的治疗反应轨迹
原创单细胞+空间蛋白组鉴定三阴乳腺癌不同的治疗反应轨迹
原创
作者，Evil Genius
欢迎来到大龄剩男相亲记，昨天下午7点多见了一个女医生，我觉得我自己就比较现实了，她更现实，着急的，实际上她94年的，我觉得不用急，结果她把医学报告拿出来了，让我看，告诉我女性超过30岁生孩子风险急剧升高，超过33岁生下的孩子是弱智的概率大大提升，然后说男女都一样，超过30岁细胞有丝分裂开始不稳定，女性一生大概400个卵子，但是只有前面的200个左右是高质量的，男性精子的数量和质量从28岁左右开始下降，再加上现在生活压力比较大，男性在抽烟喝酒熬夜等，这个生理只会提前。
说实话，我第一次见女方这么说。
还记得在上海的时候，女人都认为35岁之前都算小呢，40岁生孩子也不晚。
对于单细胞空间如何走向临床，其实是一个很深的课题，毕竟转录组层面不是根本，只是表象，但是空间排布确实反映了很多临床信息，在临检公司看病理切片是一个非常专业且很大的部门。
衡量靶药是否有效，目前最常见的办法还是做NGS，但是空间病理信息也不可或缺，那么从研究的角度看，需要制定策略以更好地确定哪些患者将从治疗中受益，哪些患者可能需要化疗或放疗等额外治疗来克服耐药性，尤其是免疫疗法。那么借助单细胞+空间的力量，也许可以深入并克服这一点。
免疫疗法仅在某些癌症组织中取得成功，即使在这些类型中，也不是所有患者都能获得临床益处。在乳腺癌中，缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子2蛋白表达的三阴性乳腺癌亚型(TNBC)是最具免疫应答性的亚型，也是唯一将免疫检查点抑制(ICI)作为标准治疗的亚型。然而，即使在TNBC中，在转移情况下，单一治疗ICI的客观反应率仅为~20%，因此后续研究仅追求ICI联合化疗和放疗(RT)。这表明需要更好地了解肿瘤免疫微环境(TME)如何决定反应。
乳腺肿瘤浸润性免疫细胞表现出巨大的异质性，包括T细胞、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞，肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)丰度与化疗和ICI反应相关。在乳腺癌和其他癌症中，研究使用了CyTOF、bulk RNA测序(RNA-seq)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)来表征ICI之前的TME，并将各种免疫谱与反应联系起来。
治疗前TME中的细胞相互作用也可能控制ICI反应。
scRNA + CODEX技术。
结果1、空间分析确定TNBC中复发的细胞空间结构
设计并实施了一项新辅助临床试验（NCT03366844）来研究pembro和局灶性放疗联合治疗TNBC患者 。50例新诊断的患者术前接受pembrots，三周后对原发乳腺肿瘤进行pembrots + RT(3组24 Gy, pembrots + RT)，然后继续进行标准治疗化疗，手术和RT，在手术时确定病理完全缓解(pCR)。淋巴结阳性患者经细针穿刺或芯针活检病理证实。 单细胞转录组部分：用磁分离CD45+和CD45-的活检样本活细胞的顶部和底部1/3部分进行单细胞测序，CD45+样本同时进行配对T细胞受体（TCR）/B细胞受体（BCR）-seq。 空间蛋白组部分：剩余的1/3部分，福尔马林固定，石蜡包埋，并使用CODEX平台，根据scRNA-seq鉴定的细胞类型，用抗体panels进行分析。
空间细胞类型的鉴定：经典marker。
空间域分析：细胞类型被分组成空间受限的domain或“区”，在活检中反复出现。为了使这一观察标准化，作者开发并应用了一种无偏机器学习方法来识别12个domain的空间细胞结构检测。d0、d1、d5和d11区上皮细胞占89%。有2个基质区(d2和d10)和1个内皮细胞区(d7)。d9区以髓系细胞为主(78%)，部分CD4+ T细胞(CD4T, 11%)。d6区为CD20+ B细胞(10%)、CD4T细胞(13%)、CD8+ T细胞(CD8T, 18%)、骨髓细胞(19%)和基质细胞(37%)的混合物。大多数CD138+浆细胞(95%)位于d8区，与上皮细胞、髓细胞和基质细胞(>10%)共存。d3区和d4区以淋巴细胞为主，d3区含CD4T最多(39%)和CD8T最多(41%)，d4区含B细胞最多(54%)。
结果2 、治疗诱导应答性TNBC免疫微环境的重塑
从不同治疗时间节点中的空间样本分析相对细胞比例(占总细胞的百分比)和细胞密度(每单位面积的细胞数)。
- At baseline, total immune cell proportions did not distinguish response groups, though immune cell density was higher in responders
- B cell dominant district d4 was the only district higher in proportion and density in responders at baseline, but T cell rich d6 was also denser at this time。
- AUROC分析也发现了类似的趋势。在治疗前，d4是唯一与应答相关的区(AUROC > 0.75)，但在RTPD1治疗后，所有免疫富集区(d3, d4, d6, d8和d9)按比例和密度在应答者中富集。
结果3、单细胞数据分析
342,749个CD45+细胞的配对scRNA-seq数据。Leiden聚类鉴定出B细胞/浆细胞、T细胞、骨髓细胞和肥大细胞。还将B细胞/浆细胞、T细胞和骨髓细胞分亚群，并使用差异基因表达分析(DGEA)和CellTypist软件来描述细胞表型。
T/NK-cells：8个subclusters， sc-t1和 sc-t7：NK-like cells，marker为NKG7，KLRB1 sc-t2：naive CD4+ /CD8+ T cells sc-t3：Tregs sc-t5：follicular-helper T cells sc-t4 and sc-t6：effector/exhausted CD8+ T cells B cells/plasma cells亚类：CD20+ B cell (sc-b0, sc-b2)，7 SDC1+ (CD138) plasma cell clusters Myeloid cells亚类：12个亚类 sc-m7：migratory DC sc-m8 and sc-m9：‘‘DC1’’ and ‘‘DC2’’
相关性分析空间域富集的细胞类型（spearman）
结果4、效应T细胞扩增与抗原呈递巨噬细胞相关
观察新抗原反应效应CD8+ T细胞特征(“neoTCR8”)，发现sc-t4和sc-t6表现出最高的表达水平，并且这种特征在应答者的早期活检中最高。仅在应答者中，这些subcluster在pembroo后扩张增加，其中sc-t6在RTPD1后持续扩张。此外，在两种治疗活检中，有反应者的sc-16扩增高于无反应者。
通过研究空间域的相关性，发现，d3和d4在其空间模式上是相关的，d6也与这两个区域以及基质富集的d2和d10相关。d8区与其他区无空间联系，而d9区与d3区和d6区均有空间联系。这些区域间的空间相关性在反应者和非反应者之间没有差异。
结果5、鉴定两组具有不同免疫轨迹的responder groups
反应性肿瘤在与反应相关的空间因素上表现出异质性。为了研究这一点，根据肿瘤在所有活检中的最大CODEX区域代表性对肿瘤进行了无偏聚类。肿瘤聚集成3组，大多数无应答的肿瘤形成一个亚组，应答的肿瘤形成两个亚组。将响应组subgroup1称为R1，所有其他响应组称为R2，而所有无响应组称为NR。
R2与免疫检查点抑制的典型反应组的表达相似度低，R1恶性细胞在base时显示出免疫治疗响应的特征
为了研究区域共定位对扩展的影响，测量了所有CODEX图像中每个区域的细胞密度，然后对位于相应二元分布上的区域对像素进行分类。然后，将每个活检中上象限的像素百分比与sc-t6扩张相关联，发现R2中d6/d9共密度与sc-t6扩张之间存在唯一的显著相关性。此外，对d6/d9共密度和sc-t6膨胀之间形成的双变量分布进行上象限富集分析发现，R1和R2总体上富集相似，但最大富集与R2 RTPD1活检相对应。
结果6、RT和抗PD-1对TNBC小鼠模型免疫微环境的影响
分析发现R1恶性细胞在base和pembro之后表达与免疫治疗反应相关的癌症基因特征，并且这些基因在RTPD1后的R2中被扩增。此外，通过对区分每种肿瘤类型的基因进行富集分析发现，R1癌细胞在base和pembro之后具有更高的MHC I、MHC II和TAP相关基因表达，并且在一次或两次活检中，这些基因在R1正常上皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞中表达上调。
结论
基于单细胞数据和CODEX分析，研究免疫细胞与非免疫细胞在空间上的浸润以及共定位情况。三阴性乳腺癌中显示无应答者（Non-responders）在治疗前后均缺乏免疫浸润，仅表现出治疗引起的微弱免疫变化；响应者Responding tumors表现出两种响应模式。在治疗前可通过分类器进行区分，其中一组在治疗前表现出高的MHC表达、存在三级淋巴结构，并表现出抗肿瘤免疫效能。另一组应答者在基线时与无应答者相似，只有在联合治疗后才会产生最大的免疫应答，其特征是细胞毒性 T 细胞和抗原呈递髓细胞相互作用。并且这些空间互作关系也在小鼠模型上得到了验证。
参考文章Single-cell and spatial profiling identify three response trajectories to pembrolizumab and radiation therapy in triple negative breast cancer
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原创声明：本文系作者授权腾讯云开发者社区发表，未经许可，不得转载。
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